二乔刺槐愈伤组织超低温保存及植株再生

摘要

植物材料在超低温保存过程中，其物质代谢、能量代谢及其它生命活动降至最低限度，从而避免了因长时间保存而带来的变异可能性。因此，超低温保存成为长期和稳定保存植物种质的有效方法之一。试验以木本植物二乔刺槐离体培养的愈伤组织作为材料，对其超低温保存方法进行研究，筛选出了适合的冻存程序，得到了50％以上的二乔刺槐愈伤组织成活率，并成功利用化冻后的二乔刺槐愈伤组织进行了体外植株再生。主要实验结果如下： 1.利用程序降温仪对二乔刺槐愈伤组织进行冻存时发现样品降温速率和冷槽降温速率之间存在一定偏差，采用较慢的降温速率和适当时间的低温停留可以缩小这一偏差，偏差的缩小有利于样品成活率的提高。 2.采用4种冰冻保护剂对二乔刺槐愈伤组织进行超低温保存，结果发现以冰冻保护剂（MS+10％DMSO+0.5mol·L-1蔗糖）处理下的愈伤组织冻后活力最高，相对成活率可达91.81％。冰冻保护剂（MS+10％DMSO+0.5mol·L-1蔗糖）可以作为二乔刺槐愈伤组织超低温保存较适宜的冰冻保护剂。 3.降温过程中降温速率和低温停留时间会显著影响二乔刺槐愈伤组织活力，某一温度段的降温方式如果不适宜将会显著影响后续结果。适宜于二乔刺槐愈伤组织的控速降温超低温保存程序为：冷槽以1℃·min-1的速率降温至-7℃停留1h后，再以0.1℃·min-1的冷却速率将样品冷却至-20℃，然后平衡1h。接下来以0.3℃·min-1的冷却速率将样品冷却至-40℃再投入液氮。 4.化冻后的愈伤组织用液体培养基（MS+5.0mg·L-16-BA+30g·L-1蔗糖）洗涤2次，暗培养2周后转于光下。冻存后的愈伤组织以旧有愈伤组织表面长出活力旺盛的新生愈伤组织颗粒继而生长的方式恢复生长，新生的愈伤组织可以顺利出芽并进行体外植株再生，再生的植株与正常植株形态上无明显差异。取出生根培养30d的健壮苗进行炼苗，其成活率可达90％以上。

目录

文摘

英文文摘

声明

致谢

1 文献综述

1.1 超低温保存的概念及其基本原理

1.1.1 超低温保存的概念

1.1.2 超低温保存的基本原理

1.2 超低温保存过程中细胞损伤机理

1.2.1 降温过程中细胞损伤机理

1.2.2 复温过程中细胞损伤机理

1.3 超低温保存方法分析

1.3.1 超低温保存方法的两种派别及其分支

1.3.2 超低温保存方法两派的异同

1.3.3 超低温保存方法两派的优缺点

1.4 超低温保存冻存前后主要步骤的意义

1.4.1 材料的选择

1.4.2 预处理

1.4.3 使用冰冻保护剂

1.4.4 恢复培养

1.5 保存材料的遗传稳定性

1.6 近年国内外植物种质资源超低温保存研究情况分析

1.7 小结与展望

2 引言

3 材料与方法

3.1 试验材料

3.2 试验方法

3.2.1 保护剂处理

3.2.2 实际降温曲线的获得

3.2.3 程序化冻存

3.2.4 材料化冻

3.2.5 冷冻材料的恢复培养及植株再生

3.2.6 TTC法测细胞活力

3.2.7 成活率的计算方法

3.3 数据分析方法

3.4 试验仪器

3.5 结果与分析

3.5.1 冷槽与样品降温不同步对二乔刺槐愈伤组织活力的影响

3.5.2 保护剂种类及浸泡时间对愈伤组织活力的影响

3.5.3 温度段0℃至-10 ℃的降温方式对愈伤组织活力的影响

3.5.4 温度段-10 ℃至-40 ℃的降温方式对愈伤组织活力的影响

3.5.5 降温终点温度对愈伤组织活力的影响

3.5.6 液氮中保存时间对成活率的影响

3.5.7 暗培养时间对冻后愈伤组织恢复生长的影响

3.5.8 超低温保存后材料的恢复生长过程

3.5.9 植株再生情况

3.6 结论与讨论

3.6.1 程序降温仪实际应用中样品温度与冷槽温度的差异

3.6.2 控速降温超低温保存体系的建立

3.6.3 愈伤组织超低温保存后的恢复生长过程

3.6.4 结论与研究展望

参考文献

图版与图版说明