一种刺槐的离体培养和植株再生的方法

摘要

本发明公开了一种刺槐的离体培养和植株再生的方法，以不同胚龄的合子胚为外植体，以MS基本培养基+MES 500mg/L+谷氨酰胺250mg/L+水解酪蛋白500mg/L+萘乙酸0.1-1.0mg/L+6-苄氨基腺嘌呤0-1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L为体细胞胚诱导培养基，直接诱导获得刺槐体细胞原胚，然后进行体细胞胚的成熟、萌发、壮苗培养获得再生植株。本发明方法中体细胞胚的诱导率高，每个外植体平均体细胞胚数达到5.4-10.8个；体细胞胚萌发率、移栽成活率高，可以在短期内形成大量优良的刺槐再生植株，是工厂化大规模生产刺槐植株的简便、快捷的技术体系。

说明书

技术领域

本发明涉及一种植物组织培养的方法，特别涉及刺槐离体培养和植株再生的方法，属于 刺槐的组织培养领域。

背景技术

刺槐(Robinia pseudoacacia L.)又称洋槐，属于豆科(Leguminosae)蝶形花亚科刺槐属 (Robinia L.)，落叶乔木，原产于美国，天然分布于美国东部阿柏拉契山脉(Appalachian.Mt.) 和奥萨克山脉(Ozank.Mt.)，20世纪初期引入我国，引进后得到迅速扩大栽植，是黄河中下游、 淮河流域、海河流域、长江下游诸省的主要用材林、薪炭林、水土保持林、海堤及河堤防护 林，仅在河北、河南、山东和山西等6省市就有40亿株。它生长速度快，是重要的速生用材 树种，其木材材质坚硬、抗压强度大、具较强的耐旱性、防腐力强。刺槐根系长有大量根瘤， 可以通过生物固氮增加土壤肥力，在维持生态平衡、提高林分质量等方面发挥重要作用。刺 槐的叶片含有粗蛋白，是优质廉价的家畜饲料资源。刺槐花营养丰富，虽花期较短但花量可 观，除直接使用外，还可生产花蜜、提取香料等。

中国对刺槐的育种研究始于20世纪70年代，至今已取得很多成就，但仍不能满足林业 生产的需要。体细胞胚再生途径是对树木进行繁育和遗传改良的重要平台，也是实现基因转 化的常用再生体系。体胚发生技术具有繁殖数量多、速度快、不受亲缘关系限制、一旦形成 结构完整的体细胞胚一般都可直接萌发形成小植株等特点，是稳定高效的植物再生体系。此 外，体细胞胚胎由单细胞起源，发育程序与合子胚相似，可作为胚胎学研究的模式系统，对 细胞全能性表达过程和细胞分化机理等理论问题的研究也具有重要意义。Laine E和Dumet D 成功将加勒比松和油棕胚性愈伤组织在超低温下保存并保持了体胚发生潜力，解冻后仍能继 续培养形成植株，这为挽救濒危植物提供了可能。刺槐的离体培养研究从20世纪50年代末 开始，80年代以后达到高潮。

到目前为止，刺槐通过形成层培养、茎培养、叶片培养、未授粉子房的培养等已获得了 完整的植株，但这些研究都集中在器官发生途径，通过体细胞胚发生途径的研究还很少。例 如，红艳以刺槐成熟种子的子叶为外植体，对刺槐体胚培养和诱导不定芽进行了研究，但体 细胞胚发生率最高也仅有36.7％。

大量研究表明，外植体的发育时期是影响体细胞胚发生的关键因素，未成熟合子胚因其 细胞全能性高、脱分化容易，在诱导体细胞胚发生时具有显著优势。大多数植物离体培养普 遍采用未成熟合子胚外植体，但过于幼嫩或过度成熟的合子胚的体胚诱导率并不理想。在整 个合子胚的发育过程中，只有一个较短的阶段具有很强的体胚发生潜能。目前，研究合子胚 发育阶段对体细胞胚诱导影响的研究很多，但就刺槐而言，由于刺槐的体细胞胚培养比较困 难，表现为体胚诱导率低、畸形胚数量多、体胚质量不高等，制约了其遗传改良的程度，也 阻碍了优良无性系的高效繁殖和快速推广。迄今为止，国内外对刺槐的体细胞胚培养的研究 相对较少，国内尚未见相关报道，国外仅Merkle et al.和Arrillaga et al.发表了这方面的研究结 果。其中，Merkle等人从开花后第1周开始，每隔一周从3棵刺槐树上选取未成熟合子胚为 外植体，以MS培养基为基本培养基，研究了外植体胚龄对体胚诱导的影响，仅从开花后4 周的一粒未成熟合子胚上观察到体细胞胚发生，其体细胞胚的诱导率低；Arrillaga等人在 Merkle的研究基础上提高了体细胞胚的诱导率，以FM培养基为基本培养基，采用开花后1-4 周的未成熟合子胚为外植体，进行体细胞胚诱导培养，试验结果表明开花后2-3周的外植体 体胚诱导率最高，仅达到12％。上述研究均是以开花后1-4天的未成熟合子胚为外植体进行 诱导培养，其诱导率低，最高诱导率仅为12％，难以满足刺槐繁殖和育种的需要，因此，建 立刺槐高效体胚发生体系势在必行。

发明内容

本发明的首要目的是针对上述现有技术存在的问题提供一种刺槐体细胞胚诱导率高、萌 发率高及稳定的刺槐离体培养再生体系的建立方法。该方法可以在较短时间内形成大量优良 的刺槐试管壮苗，可进行规模化、工厂化生产，可用于刺槐转化体系研究，也可以用于分子 育种研究。

为实现上述目的，本发明一方面提供一种刺槐繁殖方法，包括如下顺序进行的步骤：

1)采集刺槐荚果；

2)将刺槐荚果进行表面灭菌处理后取出其合子胚，获得无菌合子胚；

3)将无菌的合子胚接种到体细胞胚诱导培养基中进行体细胞胚诱导培养，诱导生成原胚；

4)将原胚接种于体细胞胚成熟培养基中进行体细胞胚的成熟培养，获得成熟的体细胞胚；

5)将成熟的体细胞胚接种于萌发培养基上进行萌发培养，获得体胚苗；

6)将体胚苗接种于壮苗培养基上进行壮苗培养，促进体胚苗的生长，获得试管壮苗；

7)将试管壮苗进行炼苗、移栽，即得。

刺槐的外植体胚龄对愈伤组织的诱导率影响显著，过嫩或过熟的幼胚均不能得到理想的 体细胞胚(即原胚)诱导结果。本发明通过大量的实验发现，处于开花后第25天至第75天 这一时间段内的刺槐荚果作为外植体，其体细胞胚诱导效果相比于其它时间段内的荚果有明 显的提高；进一步的实验发现，采集处于刺槐开花后第45天至第65天这一时间段内的荚果 作为外植体的繁殖效果有进一步的提高，采用处于刺槐开花后第55天至第65天这一时间段 内的荚果作为外植体的繁殖效果得到了更进一步的提高，采用处于开花后第55天的刺槐荚果 作为外植体取得了最好的繁殖效果：采集刺槐开花后第55天的荚果中的未成熟合子胚在所述 诱导培养基上的体细胞胚(原胚)诱导率均高于其它时期的外植体，其体细胞胚诱导率为 92.4％，体胚萌发率为82.48-100％，均明显高于其它时段的外植体，所以本发明最优选采集 处于开花后第55天的刺槐荚果作为外植体。

其中，步骤2)中所述灭菌处理包括如下顺序进行的步骤：

A)将采集的刺槐荚果用无菌水洗净后，用酒精浸泡荚果后，用无菌水冲洗干净；

B)用HgCl₂溶液浸泡荚果，用无菌水冲洗干净；

C)吸干荚果表面水分后从荚果中取出合子胚，即得。

特别是，步骤A)中所述的酒精的体积百分比浓度为75％；浸泡时间为30s；无菌水冲 洗3-5次。

特别是，步骤B)中所述HgCl₂溶液的质量百分比浓度为0.1％；浸泡时间为3-7min，优 选为5min；无菌水冲洗5-6次。

其中，步骤3)中所述体细胞胚诱导培养基是MS基本培养基+2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES) 500mg/L+谷氨酰胺250mg/L+水解酪蛋白500mg/L+萘乙酸0.1-1.0mg/L+6-苄氨基腺嘌呤 0-1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L，pH值为5.8。

特别是，体细胞胚诱导培养基优选为：MS基本培养基+MES 500mg/L+谷氨酰胺 250mg/L+水解酪蛋白500mg/L+萘乙酸0.1-1.0mg/L+6-苄氨基腺嘌呤0.1-1.0mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂6g/L，pH值为5.8；进一步优选为：MS基本培养基+MES 500mg/L+谷氨酰胺 250mg/L+水解酪蛋白500mg/L+萘乙酸0.5mg/L+6-苄氨基腺嘌呤0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼 脂6g/L，pH值为5.8。

特别是，将从开花后第4-11周的荚果中获得的未成熟合子胚整体接种到所述体细胞胚诱 导培养基中进行所述的体细胞胚诱导培养。

特别是，步骤3)中所述体细胞胚诱导培养在以下条件下进行：黑暗条件，培养温度为 26±2℃。

尤其是，体细胞胚诱导培养过程中相对湿度为70-75％。

其中，步骤4)中所述的体细胞胚成熟培养基为MS基本培养基+水解酪蛋白500mg/L+ 蔗糖30g/L+琼脂6g/L，pH值为5.8；步骤5)中所述的萌发培养基为MS基本培养基+蔗糖 30g/L+琼脂6g/L，pH值为5.8；步骤6)中所述的壮苗培养基为MS基本培养基+IBA 0.2mg/L +蔗糖30g/L+琼脂6g/L，pH值为5.8。

特别是，步骤4)中所述体细胞胚成熟培养在以下条件下进行：培养温度为26±2℃，光 照强度为1500-2000lux，光照周期为14-16小时光照/8-10小时黑暗。

尤其是，体细胞胚成熟培养过程中相对湿度为70-75％。

特别是，步骤5)中所述萌发培养在以下条件下进行：培养温度为26±2℃，光照强度为 1500-2000lux，光照周期为14-16小时光照/8-10小时黑暗。

尤其是，萌发培养过程中相对湿度为70-75％。

特别是，步骤6)中所述壮苗培养在以下条件下进行：培养温度为26±2℃，光照强度为 1500-2000lux，光照周期为14-16小时光照/8-10小时黑暗。

尤其是，壮苗培养过程中相对湿度为70-75％。

其中，步骤7)中所述的炼苗、移栽包括如下顺序进行的步骤：打开培养瓶的瓶盖，在 移栽室中炼苗1天；然后将试管壮苗取出，用自来水洗净试管壮苗根部残留的琼脂培养基， 移栽到刺槐无土栽培基质中进行移栽培养。

特别是，还包括将移栽培养5-6周后植株再定植于大田。

特别是，还包括将试管壮苗放置于遮光50％的自然光光照强度下培养5-10天后再打开培 养瓶瓶盖。

特别是，所述刺槐无土栽培基质由珍珠岩、蛭石组成，其中珍珠岩与蛭石的体积之比为 1∶1。

特别是，移栽培养是自然光光照条件下，培养5-6周

尤其是，移栽培养温度为25±5℃、相对湿度为56-90％。

本发明的刺槐的繁殖方法具有以下优点：

1、本发明利用刺槐未成熟合子胚进行离体快速繁殖，每个培养阶段所采用的基本培养基 的都是MS基本培养基，具有无机盐浓度高，特别是硝酸盐、钾和铵的含量高，可以为组 织生长提供所需矿质营养和促进体细胞胚诱导、成熟和萌发生长。

2、本发明的繁殖方法中刺槐繁殖效率高，培养基中添加植物生长调节剂利于体细胞胚直 接从外植体上进行诱导、增殖，成熟和萌发，本发明中使用的刺槐培养基中营养物质组成合 理，用量和配比适宜，培育结果重复性高，再生体系稳定，体细胞胚的诱导率63.10-92.40％， 每个外植体平均体细胞胚数达到5.4-10.8个。

3、本发明方法培育的刺槐再生植株生长健壮、繁殖系数高，体细胞胚萌发率高，达到 72-100％；移栽成活率高，达到100％，是工厂化大规模生产刺槐植株的简便、快捷的技术体 系。

附图说明

图1是刺槐未成熟合子胚的体细胞胚诱导培养获得的原胚；

图2是刺槐原胚成熟培养得到的成熟体细胞胚；

图3是刺槐成熟体细胞胚薄层切片的显微镜观测照片；

图4是刺槐成熟体细胞胚萌发培养得到的体胚苗；

图5是刺槐体胚苗壮苗培养得到的试管壮苗；

图6是移栽于容器的刺槐幼苗。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清 楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该 理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或 替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1

一、试验材料

1、本发明以北京市延庆米家堡苗圃生长良好的二倍体刺槐实生苗群体为取材资源，选 取10棵生长良好、干型较直、结实率高的母树(各株之间的间隔大于50米)，在2010年6 月到9月间，采集开花后第4-12周的刺槐不同发育阶段的合子胚作为外植体试验材料，每间 隔10天采集一次，每次采集500个荚果，即采集开花后25、35、45、55、65、75天的荚果， 每次采集500个荚果，将当天采集的荚果在冰盒中低温保存带回实验室，之后放在4℃的冰 箱里冷藏备用。

2、植物生长调节剂

本发明中所使用的植物生长调节物质采用国产萘乙酸(NAA)、6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)。

3、培养基的配制：

(1)“MS基本培养基”的组成或配制方法；

表1MS培养基(Murashige and Skoog，1962)

上述MS培养基母液配好后，储存于4℃冰箱待用。根据配置培养基的数量，称量所需 琼脂和蔗糖，将其倒入欲配培养基体积3/4的无菌水中，顺序加入所需的大量元素母液、微 量元素母液和有机成分母液，每加入一种都充分搅拌，最后加水定容至培养基最终体积，用 pH计测试培养基酸碱度，用1mol/L的NaOH或1mol/L的HCl将pH值调整至5.8。

(2)体细胞胚诱导培养基：MS基本培养基添加NAA 0.1-1.0mg/L、6-BA0-1.0mg/L、 MES 500mg/L、谷氨酰胺250mg/L、水解酪蛋白500mg/L、蔗糖30g/L、琼脂6g/L，调节 pH值为5.8，培养基在121℃下恒温灭菌15分钟。

(3)成熟培养基：MS基本培养基添加水解酪蛋白500mg/L、蔗糖30g/L、琼脂6g/L， 调节pH值为5.8。培养基在121℃下恒温灭菌15分钟。

(4)萌发培养基：MS基本培养基添加蔗糖30g/L、琼脂6g/L，调节pH值为5.8，培 养基在121℃下恒温灭菌15分钟。

(5)壮苗培养基：MS基本培养基添加IBA 0.2mg/L、蔗糖30g/L、琼脂6g/L，调节 pH值为5.8，培养基在121℃下恒温灭菌15分钟。

4、培养条件

体细胞胚诱导培养的培养条件：封闭式组织培养室，黑暗条件下，培养温度为26±2℃。

体细胞胚成熟培养、成熟体细胞胚萌发培养、体胚苗壮苗培养的培养条件：培养温度为 26±2℃，光照强度为1500-2000lux，光照周期为14-16小时光照/8-10小时黑暗。

二、试验方法

1、外植体的灭菌

分别将采集的开花后25、35、45、55、65、75天的荚果用水洗净，在超净工作台上用体 积百分比浓度为75％的酒精浸泡荚果30s后，用无菌水冲洗数次(3-5次)；接着用质量百分 比浓度为0.1％的HgCl₂溶液浸泡荚果3-7min(优选为5min)，用无菌水冲洗数次(5-6次)； 然后将荚果放在无菌干燥的滤纸上吸干表面水分后从荚果中取出未成熟的种子，即未成熟的 合子胚，得到开花后25、35、45、55、65、75天的表面灭菌的未成熟合子胚备用。

2、体细胞胚诱导培养

在超净工作台中将开花后25、35、45、55、65、75天并且表面灭菌的未成熟合子胚整体 作为外植体接种于体细胞胚诱导培养基中，在黑暗条件下进行刺槐体细胞胚的诱导培养，每 3-4周继代一次，即将灭菌的未成熟合子胚培养3-4周之后取出，置于另一新鲜的体细胞胚诱 导培养基中继续进行体细胞胚的诱导培养，以保持培养基内含有充足的养料和水分，其中， 体细胞胚诱导培养基中所用6-BA为0.5mg/L，NAA为0.5mg/L，诱导培养温度为(26±2) ℃，培养过程中相对湿度为70-75％，诱导培养6周后在外植体的边缘部位，可以观察到大小 不一的胚状体突起，呈黄绿色，多分散分布，继代培养2次后，获得原胚(如图1)，统计诱 导得到原胚外植体数，计算体胚诱导率，结果如表2所示。

在体细胞胚诱导培养过程中，每次处理接种未成熟合子胚10个，重复处理3次。

体细胞胚诱导率(％)＝诱导出体细胞胚(原胚)的外植体数/接种外植体总数×100％。

3、体细胞胚的成熟培养

将原胚整体转接到体细胞胚成熟培养基上进行体细胞胚成熟培养，其中培养条件如下： 培养温度26±2℃，光周期为16h光照/8h黑暗，光照强度为1500-2000Lux，相对湿度为70-75％， 体细胞胚成熟培养过程中每3周继代一次。培养4周后，原胚个体增大，颜色逐渐变绿，形 成类似于合子胚的有机体，获得成熟体细胞胚(如图2所示)。

将诱导得到的体细胞胚用琼脂糖包埋固定，用徕卡UC6型全自动震动超薄切片机切片， 厚度为100微米，然后用罗丹明染色液染色，在Olympus光学显微镜下观察，显微镜观测结 果如图3，镜检结果显示体细胞胚已发育到子叶期，此时的体细胞胚具有根分生组织和茎分 生组织，表现明显的双极性。

4、体细胞胚的萌发培养

将成熟的体细胞胚从外植体块上分离下来，转接到体细胞胚萌发培养基上，置于26±2℃ 条件下，在光周期为16h光照/8h黑暗，光照强度为1500-2000Lux条件下培养，萌发培养过 程中的相对湿度为70-75％，成熟体细胞胚下胚轴伸长，快速生长，培养4周后，成熟体细胞 胚的顶端的子叶展开，另一端分化出明显的根生长端，形成体胚苗(如图4)，统计萌发得到 体胚苗数，计算体细胞胚萌发率(体胚萌发率)，结果如表2。

在体细胞胚萌发培养过程中，每次处理接种体细胞胚10个，重复处理3次。

体胚萌发率(％)＝萌发得到的再生体胚苗数/接种体细胞胚总数×100％

5、体胚苗的壮苗培养

将体胚苗整体转移到壮苗培养基中，置于26±2℃条件下，在光周期为16h光照/8h黑暗， 光照强度为1500-2000Lux条件下进行壮苗培养，壮苗培养过程中的相对湿度为70-75％，体 胚苗在壮苗培养过程中每4周继代一次，体胚苗的根逐渐伸长，形成主根和侧根，胚芽发育 为茎和叶，培养6周后，得到试管壮苗(如图5)。

6、试管壮苗的炼苗、移栽、定植

将试管壮苗培养瓶置于有遮光条件(遮光率为50％)的炼苗室内培养5-10天，然后打开 培养瓶瓶盖，在移栽室中炼苗培养1天后，取出植株，用自来水洗净试管壮苗根部残留的琼 脂培养基，移栽到刺槐无土栽培基质(珍珠岩、蛭石，珍珠岩与蛭石的体积之比为1∶1)中在 移栽室进行容器培养，移栽培养温度为25±5℃、相对湿度为56-90％，自然光照培养7-10天 后，统计移栽成活率，达到100％，如图6所示。移栽5-6周后将刺槐幼苗再定植于大田。

实施例2

除了体细胞胚诱导培养过程中，体细胞胚诱导培养基所用6-BA为1.0mg/L，NAA为1.0 mg/L之外，其余与实施例1相同，数据分析结果如表2所示。

表2体细胞胚诱导培养结果

实施例3

除了体细胞胚诱导培养过程中，体细胞胚诱导培养基所用6-BA为0.1mg/L，NAA为0.1 mg/L之外，其余与实施例1相同，数据分析结果如表3所示。

实施例4

除了体细胞胚诱导培养过程中，体细胞胚诱导培养基所用6-BA为0.1mg/L，NAA为 0.5mg/L之外，其余与实施例1相同，数据分析结果如表3所示。

表3体细胞胚诱导培养结果

实施例5

除了体细胞胚诱导培养过程中，体细胞胚诱导培养基所用6-BA为0mg/L，NAA为0.1mg/L 之外，其余与实施例1相同，数据分析结果如表4所示。

实施例6

除了体细胞胚诱导培养过程中，体细胞胚诱导培养基所用6-BA为0.5mg/L，NAA为 1.0mg/L之外，其余与实施例1相同，数据分析结果如表4所示。

表4体细胞胚诱导培养结果

有表2、3、4的试验结果可以得出：

1、外植体胚龄对体细胞胚的直接诱导率影响显著(p＜0.05)，过嫩(早于开花后45天) 或过熟(晚于开花后65天)的幼胚均不能得到理想的体胚诱导结果。但是各个生长调节剂的 浓度组合诱导下的体细胞胚发生率趋势大致相同，开花后55天采集的未成熟合子胚在各个生 长调节剂浓度下的体胚发生率均高于其他发育阶段的外植体。

2、本发明方法中以MS为基本培养基，以添加NAA 0.5mg/L、6-BA 0.5mg/L、MES 500mg/L、谷氨酰胺250mg/L、水解酪蛋白500mg/L、蔗糖30g/L、琼脂6g/L，pH值为5.8 的培养基为体细胞胚诱导培养基，体细胞胚诱导率高，对单个外植体的平均体胚诱导数影响 显著(p＜0.05)。

3、本发明中开花后55天的外植体体胚诱导率为92.40±0.12％，每个外植体的平均体胚 数为10.80±0.17个，均明显高于其他时期的外植体，以开花后55天为未成熟合子胚取材的 最佳时期。

4、本发明方法中外植体胚龄对体细胞胚的萌发得率影响显著，体细胞胚的萌发得率高， 达到72-100％，开花后55天采集的未成熟合子胚的萌发得率均高于其他发育阶段的外植体， 体细胞胚萌发得率达到82-100％。