烟夜蛾感觉神经元膜蛋白基因的克隆、序列分析、原核及组织特异性表达

摘要

昆虫的嗅觉对其栖息地的选择、觅食、群集、繁殖以及信息传递等行为都具有重要的作用。对昆虫嗅觉机理的深入研究，是探索农业害虫专一性防治的基础，并有利于探明昆虫内在的行为机制，解释昆虫各种生命行为与寄主植物的协同进化机制，同时还可以为研发与环境兼容性好，对天敌无害的高效害虫引诱剂和趋避剂提供依据。感觉神经元膜蛋白基因（sensory neuron membrane protein， SNMP）是属于人类基因中CD36基因家族的一类，是CD36家族中唯一在神经元中发现的基因。SNMPs是位于嗅觉受体神经元上的嗅觉特异性蛋白，具有2个跨膜区域，分别位于靠近C2端和N2端，以及一个大的胞外环。近些年的诸多研究表明，SNMPs在气味鉴别中可能扮演着重要的角色。在昆虫中，SNMP/CD36基因家族被分为主要的三个群体，SNMPs属于群体三，其又被分为两个小的亚群即SNMP1和SNMP2。本文以烟草、辣椒等经济作物上的主要害虫烟夜蛾Helicoverpa assulta（Guenée）为研究对象，利用分子生物学技术对烟夜蛾感觉神经元膜蛋白（SNMP）基因进行了克隆、原核和组织特异性表达，主要结果如下： （1）根据棉铃虫SNMP基因完整cDNA序列（Genbank accession no．AF462067）设计特异性引物，利用RT-PCR方法对烟夜蛾SNMP基因完整开放阅读框架（ORF）进行扩增、克隆并测序。结果表明：获得的ORF序列与近缘昆虫的序列具有高度的一致性；序列分析结果表明，烟夜蛾SNMP基因ORF全长1572 bp，编码523个氨基酸残基，预测分子量为59．2 kDa，等电点为6．54，该基因暂命名为HassSNMP。序列比对结果表明，烟夜蛾与其他昆虫的SNMP1基因推导表达的氨基酸序列具有较高的一致性，属于SNMP1。根据氨基酸序列建立系统发育树，结果显示，两近缘种烟夜蛾和棉铃虫的SNMP聚在了一起，与其它几种昆虫的SNMP各自分开。此结果在一定程度上说明，昆虫的亲缘关系越近，其氨基酸同源性越高。同源性分析表明，烟夜蛾SNMP基因与其它鳞翅目昆虫的SNMP基因同源性较高，达70％以上，其中与棉铃虫和烟芽夜蛾的同源性达97％和95％。 （2）在预测HassSNMP跨膜区时发现，HassSNMP与HarmSNMP一样也具有两个跨膜区而且位置是一样的，这表明HassSNMP具有膜蛋白的典型特征。 （3）成功构建了烟夜蛾SNMP基因的原核表达载体，分别导入大肠杆菌BL21（DE3）细胞中，经过IPTG诱导以及SDS-PAGE和Western blot分析，结果表明，烟夜蛾SNMP基因虽然可在大肠杆菌中转录，但目的蛋白不能正常表达。 （4）利用RT-PCR方法，研究了SNMP基因在烟夜蛾不同发育期和不同组织中的表达，结果表明，SNMP在烟夜蛾触角、头（去掉触角）、喙和足中表达，其中在触角中的表达量最高，且在雌雄触角中的表达量差异不显著，在喙中也有较高的表达量，而在胸和腹中没有表达；此外，在成虫、十日龄蛹以及卵中也有该基因的表达，但在卵内的表达量相对较低，在幼虫、一日龄蛹、四日龄蛹和七日龄蛹中没有表达。

目录

文摘

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致谢

1 文献综述

1.1 昆虫嗅觉系统研究

1.1.1 昆虫触角化学感器形态、结构与功能的研究

1.1.2 昆虫嗅觉系统相关蛋白的研究

1.1.3 昆虫嗅觉系统识别气味的作用机理

2 引言

3. 材料与方法

3.1 供试材料

3.1.1 供试昆虫

3.1.2 供试菌种及质粒

3.1.3 主要试剂及工具酶

3.1.4 试剂盒

3.1.5 缓冲溶液

3.1.6 SDS-PAGE电泳试剂

3.1.7 Western blot所用溶液

3.1.8 培养基

3.1.9 碱法小量质粒抽提液

3.1.10 其它溶液

3.2 实验方法

3.2.1 烟夜蛾感觉神经元膜蛋白(HassSNMP)基因的克隆

3.2.2 烟夜蛾SNMP基因原核表达载体的构建、转化及鉴定和表达

3.2.3 烟夜蛾SNMP基因在不同组织和发育时期的表达

4 结果与分析

4.1 烟夜蛾感觉神经元膜蛋白基因的扩增、克隆和序列分析

4.1.1 烟夜蛾感觉神经无膜蛋白基因的扩增和克隆

4.1.2 序列分析

4.2 烟夜蛾感觉神经元膜蛋白基因原核表达

4.3 烟夜蛾感觉神经元膜蛋白基因的时空表达

5 结论与讨论

5.1 结论

5.2 讨论

参考文献：