鸽卵清蛋白基因和甾体激素受体基因的克隆、组织特异性表达及ERα基因在输卵管上皮细胞中功能的研究

摘要

甾体激素在维持生命、调节生殖功能、免疫调节、应激反应等方面有明确的作用。甾体激素主要通过甾体激素受体发挥生物学效应，本研究在克隆了鸽子卵清蛋白(OVA)、雌激素受体α（ERα）、雌激素受体β(ERβ)、孕酮受体(PGR)和糖皮质激素受体(GR)基因的cDNA序列的基础上，利用实时荧光定量PCR方法，研究了上述基因的组织表达分布、表达丰度以及繁殖周期中输卵管和卵巢的表达变化规律。成功培养鸽子输卵管上皮细胞(OECs)，并用RNA干扰(RNAi)技术研究了ERα基因对鸽子OVA表达的调控作用。主要研究结果如下:
　　1.鸽子OVA、ERα、ERβ、GR和PGR基因cDNA序列的获得与分析
　　利用反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）和cDNA末端快速扩增(RACE)技术，首次克隆了鸽子OVA、ERα、ERβ和GR全长编码序列(coding sequence，CDS)，以及PGR部分cDNA序列。结果表明，鸽子OVA基因eDNA全长为1433bp(GenBank登录号:JQ345718)，其中包括117bp的5'UTR（untranslated region，UTR），1161bp的编码区(coding region，CDS)和154bp的3'UTR，共编码386个氨基酸。与鸸鹋的同源性为71％，与鸡的同源性为67％。
　　本实验获得鸽子ERα基因全长CDS序列（GenBank登录号:JX413115.1），其中包括27bp的5'UTR、1764bp的编码区和39bp的3'UTR。翻译编码587个氨基酸，与鸡的同源性为99％，与爬行动物中鳄鱼和龟的同源性分别为92％和91％，与人的同源性为78％。
　　本实验获得鸽子ERβ基因全长cDNA序列（GenBank登录号:JX413116.1）。其中包括274bp的5'UTR、1662bp的编码区和496bp的3'UTR。翻译编码553个氨基酸，与鸡的同源性为95％，与爬行动物中鳄鱼和龟的同源性分别为88％和86％，与人的同源性为79％。
　　实验获得鸽子GR基因cDNA序列2438bp，其中包括全长为2313bp的CDS，102bp的5'UTR序列，以及18bp的3'UTR序列。翻译编码770个氨基酸，与鸡的同源性为94％，与鳄鱼的同源性为85％，与人的同源性为75％。
　　实验获得鸽子PGR基因cDNA序列1063bp，全部为CDS区域。共翻译编码354个氨基酸，该氨基酸片段包括鸽子PGR配体结合域的一部分以及DNA结合结构域的一部分。
　　2.OVA、ERα、ERβ、PGR和GR基因mRNA的组织表达分布、组织表达丰度及不同繁殖阶段输卵管和卵巢中的表达变化研究
　　应用实时荧光定量PCR方法研究了OVA、ERα、ERβ、PGR和GR基因在鸽子体内的组织表达分布和表达丰度，以及上述基因在鸽子繁殖不同时期（产蛋期、就巢期和哺乳期）卵巢和输卵管中表达差异。结果表明鸽子的OVA基因mRNA除了在输卵管高表达外，在其他组织都痕量表达;鸽子的ERα基因在各个组织中广泛表达，在输卵管的表达量最高，在肝中表达量也较高，在肺里表达量最低;鸽子的ERβ基因在卵巢和肾脏中的表达量最高，在肝、嗉囊和胃中表达量也较高，在肺、腹脂、胰、心和骨骼肌里痕量表达;鸽子的PGR基因在多个组织中有表达，在输卵管中表达量最高，在睾丸中表达量也较高，在胰中表达量最低;鸽子的GR基因广泛表达，在睾丸中表达量最高，在嗉囊中表达量最低。
　　不同繁殖时期差异表达结果显示:产蛋结束后，鸽子的输卵管中OVA表达量显著下降;ERα在输卵管中，产蛋期之后ERα的表达量升高，就巢期最高，与产蛋期差异显著;在卵巢中，就巢期时ERα表达量最低，但与其他阶段的表达差异不显著;ERβ在就巢期的卵巢中高表达，产蛋期表达量最低;PGR基因在产蛋期的卵巢和输卵管中高表达，产蛋后表达量下降;GR基因在产蛋期的卵巢和输卵管中表达量最低，与其他两个时期的差异不显著。
　　3.鸽子OECs培养
　　以产蛋期雌鸽为材料，通过输卵管内皮组织分离、胶原酶和胰酶复合消化、细胞纯化等技术环节的摸索，原代培养了鸽子OECs，同时通过细胞形态观察及荧光定量PCR检测OVA基因mRNA表达量的方法鉴定所获得的细胞。为进一步探讨禽类OVA基因转录的分子机理建立了细胞模型。
　　4.鸽子ERα对OECs转录OVA基因mRNA的调控研究
　　通过鸽子OECs的培养，利用RNAi研究了ERα基因对鸽子OECs OVA基因mRNA转录调控，结果表明，干扰鸽子ERα基因mRNA后，OVA基因mRNA的表达量显著升高，说明ERα在甾体激素调控OVA分泌过程中发挥重要作用。

目录

声明

摘要

缩略词

前言

第一章 文献综述

第一节 家禽卵清蛋白(OVA)基因的研究进展

1．1．1 OVA的结构特点

1．1．2 OVA的表达调控

1．1．3 利用OVA的高效表达特点进行生物技术研究

1．1．4 小结与展望

第二节 动物甾体激素受体(SHRs)的研究进展

1．2．1 核受体(NRs)的特点

1．2．2 雌激素受体(ERs)基因

1．2．3 孕酮受体(PGR)基因

1．2．4 糖皮质激素受体(GR)基因

第三节 动物输卵管上皮细胞(OECs)培养的研究进展

1．3．1 哺乳动物的OECs培养及应用

1．3．2 家禽OECs培养

1．3．3 小结与展望

第四节 本研究的目的与意义

1．4．1 本研究的目的与意义

1．4．2 主要研究内容

第二章 鸽OVA，ERα，ERβ，PGR，GR基因的cDNA克隆及序列分析

第一节 鸽子OVA基因全长cDNA克隆及序列分析

2．1．1 引言

2．1．2 材料与方法

2．1．3 结果与分析

2．1．4 讨论

第二节 鸽子ERs基因全长CDS序列的克隆及分析

2．2．1 引言

2．2．2 材料与方法

2．2．3 结果与分析

2．2．4 讨论

第三节 鸽子PGR基因部分序列的克隆

2．3．1 引言

2．3．2 材料与方法

2．3．3 结果与分析

2．3．4 讨论

第四节 鸽子GR基因全长CDS序列的克隆与分析

2．4．1 引言

2．4．2 材料与方法

2．4．3 结果与分析

2．4．4 讨论

第三章 鸽子OVA，ERα，ERβ，PGR，GR基因表达的组织特异性研究

第一节 鸽子OVA，ERα，ERβ，PGR，GR基因的不同组织表达差异和表达丰度研究

3．1．1 引言

3．1．2 材料与方法

3．1．3 结果与分析

3．1．4 讨论

第二节 鸽子OVA，ERα，ERβ，PGR，GR基因繁殖周期的不同阶段卵巢和输卵管中的表达情况

3．2．1 引言

3．2．2 材料与方法

3．2．3 结果与分析

3．2．4 讨论

第四章 鸽子输卵管上皮细胞(OECs)的分离培养及甾体激素和ERα对OVA表达调控研究

第一节 鸽子输卵管上皮细胞(OECs)的分离培养

4．1．1 引言

4．1．2 材料与方法

4．1．3 结果与分析

4．1．4 讨论

第二节 鸽子ERα特异性siRNA(ER α-siRNA)的设计、筛选及对鸽子输卯管上皮细胞(OECs)表达OVA的影响

4．2．1 引言

4．2．2 材料与方法

4．2．3 结果与分析

4．2．4 讨论

全文总结

创新点与研究展望

参考文献

致谢

攻读博士期间发表的论文