人FcγRⅠ的原核表达、真核表达及线性结合表位的初步鉴定

摘要

Fc受体(FcR)是特异亲和免疫球蛋白(Ig)Fc片段的细胞表面分子,在免疫辅助细胞和效应细胞均有表达,具有许多重要的生理功能,是细胞免疫与体液免疫的联系纽带,在机体免疫调节中起主要作用。抗体介导的炎性反应可通过抑制型和激活型FcR进行调节,因此FcR是治疗自身免疫性疾病和过敏理想的药物靶标。本研究利用化学合成多肽初步鉴定了人IgGFc受体(FcγR)的线性配体结合表位,是首次开展FcR线性配体结合表位的探索研究,对深入了解FcγR-IgG相互作用的分子基础有重要意义,为FcR靶标药物的分子设计提供新了的思路。
　　 人FcγRⅠ(CD64)为高亲和力受体,能高亲和力结合人IgG单体,胞外区含有3个Ig样结构域。本研究中将huFcγRⅠ编码区 cDNA亚克隆到表达载体pcDNA3中,受体分子在COS-7细胞表面表达,然后通过玫瑰花环试验测定huFcγRⅠ的配体特异性,IgG-RBC在huFcγRⅠ转染细胞上形成了明显的玫瑰花环。将huFcγRⅠ胞外区cDNA亚克隆到原核表达载体pGEX-6P-1,在大肠杆菌BL21中表达了huFcγRⅠ胞外区,但朱能成功从包涵体中复性huFcγRI重组蛋白。为了鉴定huFcγRI的线性配体结合表位,在EC2结构域设计合成huFcγRⅠ多肽,Dot-blot结果显示huFcγRⅠ的122-133位多肽CLYYRNGKAFKFF和144-153位多肽CTNISHNGTYH特异结合人IgG,位于受体EC2结构域C-C’环和E-F环。

目录

文摘

英文文摘

致谢

第1章 文献综述

1.1 关于Fc受体的分类和命名

1.2 IgG Fc受体的生物学特性

1.2.1 FcγRⅠ(CD64)

1.2.2 FcγRⅡ(CD32)

1.2.3 FcγRⅢ(CD16)

1.2.4 boFcγ2R

1.2.5 moFcγRⅣ

1.3 FcγR的免疫学功能

1.3.1 介导ADCC作用

1.3.2 介导DC细胞抗原提呈

1.3.3 介导DC细胞抗原提呈

1.3.4 介导细胞吞噬作用

1.4 FcγR与抗体的相互作用

1.4.1 FcγR结构

1.4.2 抗体结构

1.4.3 FcγR-抗体相互作用

1.5 FcγR药物靶标研究

第2章 人FcγRⅠ基因的原核表达

2.1 材料

2.1.1 菌株、质粒、酶

2.1.2 试剂配制

2.1.3 主要试剂盒

2.2 方法

2.2.1 人外周血白细胞分离及其cDNA合成

2.2.2 大肠杆菌JM109感受态的制备

2.2.3 huFcγRⅠ基因的克隆

2.2.4 原核表达质粒peThuRⅠ的构建

2.2.5 蛋白表达

2.2.6 包涵体纯化

2.3 结果

2.3.1 huFcγRⅠ基因的扩增

2.3.2 huFcγRⅠ原核表达质粒的构建

2.4 讨论

2.4.1 huFcγRⅠ重组蛋白的表达

第3章 huFcγRⅠ基因的真核表达

3.1 材料

3.1.1 菌株、质粒、酶

3.1.2 细胞18

3.1.3 试剂配制

3.2 方法

3.2.1 真核表达质粒pcDNA3-huFcγRⅠ的构建

3.2.2 真核表达质粒pc3huγ的构建

3.2.3 细胞转染

3.2.4 人IgG的纯化与标记

3.2.5 抗鸡红细胞(RBC)IgG的制备

3.2.7 玫瑰花环试验

3.2.8 huFcγRⅠ与γ链共转染稳定表达细胞系的建立

3.2.9 共转染稳定表达细胞系的鉴定

3.3 结果

3.3.1 真核表达质粒pcDNA3-huFcγRⅠ的构建

3.3.2 真核表达质粒pc3huγ的构建

3.3.3 抗鸡RBC小鼠IgG的制备

3.3.4 共转染稳定表达细胞系的鉴定

3.4 讨论

第4章 人FcγRⅠ线性结合表位的初步筛选与鉴定

4.1 材料和方法

4.1.1 主要仪器

4.1.2 huFcγRⅠ多肽设计

4.1.3 Fmoc固相多肽合成

4.1.4 合成多肽的沉淀和脱盐纯化

4.1.5 合成多肽的纯度和结构特性鉴定

4.1.6 合成多肽的溶解和保存

4.1.7 huFcγRⅠ受体线性结合表位的初步鉴定

4.2 结果

4.3 讨论

全文结论

1.huFcγRⅠ胞外区原核表达

2.稳定表达表达huFcγR Ⅰ的细胞系

3.利用合成多肽初步定位了huFcγRⅠ的线性结合表位

参考文献

科研成果