猪源肠球菌多重PCR诊断方法的建立及应用

摘要

肠球菌不但是引起医院内住院病人的心内膜炎、腹膜炎、尿道炎和脑膜炎等主要原因，近年来对猪、羊、鸡和鸭等动物的感染也越来越多。肠球菌种虽已增加到41个种，但引起人和动物感染的主要是粪肠球菌和屎肠球菌。在肠球菌致病的毒力因子中，ClyA、AS、和Esp被认为是肠球菌致病的主要毒力因子。我们根据GenBank公布的肠球菌16SrRNA基因序列、粪肠球菌和屎肠球菌sodA基因序列以及cylA、AS、esp的基因序列，分别设计能同时鉴定粪肠球菌和屎肠球菌的PCR方法和能同时测定肠球菌属和cylA、AS、esp三种主要毒力基因PCR方法，并对临床分离株进行鉴定和检测，以期为快速鉴定粪肠球菌和屎肠球菌感染和致病机理研究奠定基础。
　　 根据GenBank公布的肠球菌16SrRNA基因序列设计肠球菌属的特异性引物，根据sodA基因序列设计粪肠球菌和屎肠球菌种特异性引物，以两株模式菌株(ATCC29212、ATCC33186)和经系统鉴定的5株猪源肠球菌基因组DNA为模板，对多重PCR反应条件进行优化，最终确立的PCR反应最佳条件为95℃5min;95℃30s，49℃1min，72℃1min10s，30个循环；72℃延伸10min，于4℃结束反应。在此条件下，粪肠球菌和屎肠球菌均可出现属和种的特异性条带，而葡萄球菌、链球菌和乳球菌均无上述条带出现，E.sanguinicola仅有肠球菌属特异性条带，而无种的特异性条带。敏感性实验表明该方法能检测DNA的最小量为1ng。为了进一步验证扩增的特异性，将PCR扩增产物克隆到pTG19-T载体中并测序，所得碱基序列与参照的相关属种的对应基因序列一致。
　　 根据GenbanK公布的cylA(溶血素A)、AS（聚类物质）和esp（表面蛋白）基因序列设计三种毒力基因检测引物，并利用已设计出的肠球菌属特异性引物建立同时检测肠球菌和三种毒力基因的多重PCR方法，用N9株（粪肠球菌，经单重PCR鉴定均携带有cylA、AS和esp毒力基因）作为多重PCR方法的扩增模板，经过优化确立PCR反应最佳条件为95℃5min;95℃30s，56℃1min，72℃1min10s，30个循环；72℃延伸10min，于4℃结束反应的反应条件。结果表明，阳性菌株均可扩增出属和三种毒力基因条带，而阴性菌株仅有属特异性条带，无毒力基因条带。敏感性实验表明该方法能检测到的最低DNA含量为100pg。
　　 利用肠球菌多重PCR诊断方法对分离自感染猪、猪粪便和鲜猪肉中疑似肠球菌菌株进行鉴定，结果表明：三种来源的样品中共分离190株疑似肠球菌菌株，177株被鉴定为肠球菌，其中，鉴定为粪肠球菌和屎肠球菌菌株158株，有19株鉴定为肠球菌属细菌，但未鉴定到种的水平。三种来源的样品中，粪肠球菌和屎肠球菌均是肠球菌属的优势菌群，其中，感染菌株和鲜肉菌株中屎肠球菌检出率最高，分别为54.3％和55％，粪便菌株中粪肠球菌检出率较高，为46.7%。毒力基因检出率以感染菌株最高，cylA、AS和esp的检出率分别为83.3%、26.4％和55.4％，而在不同来源的三种毒力基因检测中，cylA基因在三种样品中检出率均较高。