鸡源大肠杆菌外排基因acrA的mRNA表达水平测定

摘要

本课题针对45株临床分离和12株诱导的鸡源大肠杆菌,根据CLSI2008推荐的方法进行外排表型筛选实验和ESBL初筛及确证实验,利用PER扩增方法对9株诱导产ESBLs肠杆菌进行ESBLs基因型和基因亚型检测,并用荧光定量RT—PCR(Real time quantitative RT—PCR)方法测定筛选出的4种菌株(①外排阳性、ESBLs阳性菌:G1、B4、C5、E3、078-A、078-B、078-C；②外排阴性、ESBLs阴性菌:N2、ZM-5、ZM-6菌；⑧外排阴性、ESBLs阳性菌:F3；④外排阴性、ESBLs阳性菌:I1、N1、078)外排基因acrA的mRNA的绝对模板数量。通过MIC值测定观察泵抑制剂对分离鸡源大肠杆菌和诱导菌株抗菌药物敏感性的影响,从表型上分析外排表型和ESBLs之间的关系,并通过对4种菌株的外排基因acrA的mRNA的绝对模板数量的测定在分子机制方面探索鸡源大肠杆菌非特异性耐药机制外排系统的过度表达和特异性耐药机制ESBLs之间的内在联系。
　　 检测结果表明,从临床分离的45株鸡源大肠杆菌中,加入泵抑制剂利血平后,筛选出35株外排阳性菌,外排阳性率为78％,从中检测出的ESBLs阳性菌筛选率为100％；加入CCCP后,筛选出42株外排阳性菌,外排阳性率为93％,从中检测出的ESBLs阳性菌筛选率为93％；诱导菌株在第三代头孢类药物的作用下,12株诱导菌均为ESBLs阳性和外排表型阳性菌。诱导后的9株诱导菌分别用TEM、CTX—M、SHV、OXA型四对引物进行扩增,其中861bpTEM型为9株,检测率为100％；905bpCTX—M型为9株检测率为100％；同时携带有TEM和CTX—M的菌株为9株,检测率为100％。诱导菌株PCR产物克隆后测序表明,TEM型序列之间的同源性为98.4％～100％,其序列与GeneBank上公布EU979560(TEM-1)同源性为100％,核苷酸序列中有突变点,但没有引起氨基酸位点的突变,所以仍属于TEM-1型广谱β-内酰胺酶。鸡大肠杆菌CTX—M型序列的同源性为96％～100％,产CTX-M基因的基因亚型分别为CTX—M-14、CTX-M-24、CTX—M-65。
　　 荧光定量结果显示,荧光定量结果显示,临床分离菌株的外排表型阳性菌中,ESBLs阳性组的acrA的mRNA的绝对模板数量为0.13×109～0.1 X1010,ESBLs阴性组acrA的的mRNA的绝对模板数量为0.22 X108,前者的的均值比后者显著高出23倍,且统计学差异极显著(P<0.01)；在外排阴性菌株中,ESBLs阳性组acrA的mRNA的绝对模板数量为0.11×108～0.16×109,ESBLs阴性组acrA的mRNA的绝对模板数量为O.32 X108～O.43 X108,前者mRNA的表达量是后者的3倍,统计学差异不显著(P>O.05)。在ESBLs阳性菌株中,外排表型阳性组acrA的mRNA的表达量为0.13×109～O.1×1010,外排表型阴性组acrA的mRNA的表达量为O.11×108～O.16X109,前者是后者的7倍,统计学差异显著(P<0.05)；在ESBLs阴性菌株中,外排表型阳性组acrA的mRNA的表达量为0.22×108,外排表型阴性组的mRNA的表达量为0.32×108～0.43×108,前者是后者的0.4倍,统计学差异不显著(P>0.05)。诱导菌株中,诱导前外排表型和ESBLs为阴性的大肠杆菌acrA基因的mRNA的表达量为0.25X108,诱导后外排表型和ESBLs为阳性组acrA的mRNA的表达量为0.2X109～0.27X109,前者是后者的9倍且统计学差异显著(P　　 综合以上结果,说明大肠杆菌的外排系统acrAB—to1C的acrA基因的过度表达与特异性耐药机制ESBLs的产生有相关性。