观赏南瓜未受精子房、胚珠离体培养及其机理研究

摘要

南瓜(Cucurbita moschata D.)又名倭瓜,具有较高的观赏及药用保健价值。目前,我国观赏类南瓜的育种理论及技术基础相对滞后,导致优良品种较少且品种更新速度慢。通过南瓜未受精胚珠离体培养的单倍体育种途径,可以人工诱导南瓜的离体雌核发育,从而快速获得单倍体以及双单倍体植株,进而迅速获得纯合的系统,为观赏类南瓜优良自交系的选育提供有效的技术手段。未受精胚珠离体培养建立的再生体系也可以作为南瓜遗传工程的理想受体系统,使隐性基因得以顺利表达。
　　 本论文以“试验南瓜1号”为材料,通过对南瓜(Cucurbita moschata D.)未授粉子房和未受精胚珠的离体培养,诱导了雌核发育,并获得了染色体数减半的胚囊植株。并以MS为基本培养基,研究了黑暗热激预处理时间、2,4-D浓度、激素组合、碳源种类和浓度等以及KT预处理和AgNO3刺激等因素对未受精胚珠诱导的影响；同时,分别采用石蜡切片法和改良苯酚品红压片法观察南瓜胚囊发育过程及根尖染色体,并利用抗微管除草剂氟乐灵和秋水仙素对南瓜进行了加倍诱导研究,旨在为建立高效的南瓜未授粉子房和未受精胚珠的培养技术和探讨雌核发育的机理,为观赏类南瓜单倍体培养奠定重要的理论基础和实践支撑。研究结果如下:
　　 1.利用石蜡切片技术系统观察了南瓜的子房胚囊发育过程。发现南瓜的子房胚囊发育时期为开花前3d至开花当天,经历单核胚囊时期(开花前3d)、双核胚囊时期(开花前2d)、四核胚囊时期(开花前1d)、成熟胚囊期(开花当天),其中成熟胚囊期(七细胞八核)胚囊为蓼型胚囊。同时发现开花当天的未受精胚珠(成熟胚囊期)的胚状体诱导率、成苗率均高于开花前1d和2d的未受精胚珠。
　　 2.黑暗热激预处理条件下南瓜未受精离体雌核诱导效果较好,其中未受精子房培养以35℃条件下黑暗热激处理6d为最佳,其出胚数和出胚率分别为4.8个、22％,与热激5d、7d差异极显著；不同胚囊时期间的诱导效果无差异。黑暗热激处理5d条件下的未受精胚珠直接培养的转绿率和胚状体诱导率最高,分别达到了80％和15％以上。
　　 3.不同浓度的2,4-D对南瓜未受精子房离体诱导影响方面,较高的2,4-D浓度可有效地启动南瓜未受精子房的雌核发育,抑制南瓜未受精胚珠胚状体的诱导；而低浓度(1.0、1.5 mg·L-1)的2,4-D能有效地诱导未受精胚珠的雌核发育。培养基中单独添加2,4-D3.5、4.0和4.5 mg·L-1条件下均有效地刺激离体雌核的发育。其中2,4-D浓度为3.5 mg·L-1时三个胚囊时期的未受精子房离体诱导胚状体率达到最高,均在4.5％以上,其次为2,4-D4.5 mg·L-1和4.0 mg·L-1处理；三种胚囊时期中的开花前0.5d(12h)未受精子房在三种2,4-D处理条件下均诱导出子叶胚,其子叶胚数分别为4个、2个和1个。在2,4-D1.0 mg·L-1和1.5 mg·L-1条件下的南瓜未受精胚珠离体培养的胚状体诱导率和转绿率较高,而低浓度或高浓度2,4-D条件下其诱导率均较低。
　　 4.南瓜未受精子房离体培养需高浓度的2,4-D、HAA和低浓度的6-BA处理:而低浓度的2,4-D、HAA和高浓度的6-BA处理可进行未受精胚珠培养。其中未受精子房诱导胚状体处理以4.0mg·L-12,4-D+0.5 mg·L-1NAA+0.5 mg.L-6-BA效果最佳；而南瓜未受精胚珠离体诱导以1.0 mg·L-12,4-D+0.25 mg·L-1NAA+1.0 mg·L-16-BA处理效果最好,其子叶胚数达到6个。
　　 5.蔗糖和葡萄糖均可作为南瓜未受精子房诱导雌核发育的碳源,其中蔗糖的诱导效果好于葡萄糖。不同蔗糖浓度条件下30g·L-1处理的胚状体诱导率最高,为8.52％；不同葡萄糖浓度处理下40g·L-1处理的胚状体诱导率最高,为4.44％。不同蔗糖浓度条件下南瓜未受精胚珠诱导胚状体效果以25g·L-1处理最好,其胚状体诱导率为83.33％,子叶胚达到7个。
　　 6.南瓜未受精胚珠诱导胚状体效果以MS+2,4-D1.0 mg·L-1+NAA0.25 mg·L-1+6-BA1.0 mg·L-1+30g·L-1蔗糖+6g·L-1琼脂处理较好,其胚状体诱导率为3.3％。其分化、再生培养基分别以MS+30g·L-1蔗糖+6g·L-1琼脂、MS+30g·L-1蔗糖+6 g·L-1琼脂+1 g·L-1活性炭效果最佳,其胚状体发育成正常植株率达70％以上。KT预处理及AgNO3处理均对未受精胚珠诱导胚状体及再生植株均具有抑制作用。另外,AgNO3处理可促进南瓜未受精胚珠分化不定芽,以16mg·L-1处理最佳。而KT预处理抑制南瓜未受精胚珠的不定芽发生,特别对开花当天的未受精胚珠抑制作用明显,其发生率率仅为3.3％,但对其他两个接种时期未受精胚珠的抑制作用稍减。同时,试验发现不定芽生长为正常植株比率较低,仅为0.3％～6.7％。
　　 7.南瓜未受精胚珠在诱导体细胞胚发生过程中IAA、ZR、GA3、ABA四种内源激素含量变化大体表现为先上升后下降的变化趋势。但其出现峰值时间和增加幅度不同,内源ABA和GA3出现峰值时间均为第30d,IAA为第40d,ZR含量为第50d:ZR增幅为第10d含量的10.57倍,其次ABA和IAA分别为7.74、6.49倍,GA3增幅最小,仅为2.02倍。说明内源IAA,ABA,ZR对体细胞胚的形成作用比较显著。在分化培养时期,四种内源激素含量总体变化是呈下降趋势。无活性炭培养基中的培养材料的IAA、ABA含量高于有活性炭的培养基,而ZR,GA3含量低于有活性炭的培养基。在分化再生阶段,四种内源激素的含量处于低水平并呈下降趋势,说明较低水平的激素含量有利于体细胞胚分化出苗。
　　 ABA/GA3、IAA/ZR、ABA/ZR三种比值中的ABA/ZR比值变化对体细胞胚成苗影响较大。
　　 8.南瓜未受精胚珠体细胞胚发生过程中,在诱导培养时期可溶性蛋白质含量呈现先升后降的规律性变化,并在在培养第20d时出现峰值。在分化培养阶段,无活性炭和有活性炭培养基中的可溶性蛋白含量也呈先升后降趋势,但出现高峰时间为第30d。
　　 9.利用改良苯酚品红染色法观察南瓜染色体数目,发现试验南瓜1号”的染色体条数为2n=44条。
　　 10.不同浓度氟乐灵和秋水仙素处理的对南瓜的倍性诱导效果不同,其中浓度为0.006％氟乐灵处理的加倍效果优于秋水仙素。并利用流式细胞仪鉴定了诱导出的南瓜幼苗的倍性。