鸡源鲍氏志贺菌O-抗原基因进化分析和O-抗原的提纯及毒性研究

摘要

鸡志贺菌病例于2004年由许兰菊、王川庆等人首次报道，志贺菌感染雏鸡主要表现为脓血痢，能够引起雏鸡死亡。研究显示志贺菌具有人禽互传的可能。O-抗原作为细菌的主要表面抗原，在细菌进化成病原菌的过程中起重要作用，又由于O-抗原具有丰富的多样性导致其O-抗原基因簇的保守性很低，因此在DNA水平上研究分子进化关系，尤其在大肠杆菌和志贺菌遗传进化关系方面，O-抗原基因簇成为最好的研究材料。本研究对鸡鲍氏志贺菌O-抗原基因簇进行破译，旨在从DNA水平上对鸡源志贺菌的起源和进化地位进行分析。获得提纯O-抗原多糖的方法及初步研究其毒性作用，旨在为从细菌内毒素方面研究鸡鲍氏志贺菌的致病作用奠定基础。具体研究如下:
　　测定鸡源鲍氏志贺菌O-抗原基因簇序列，进行遗传进化分析，并对其基因功能预测。采用长程PCR方法扩增O-抗原基因簇，设计6对相互嵌合引物，克隆测序，拼接后获得全基因序列，用生物信息学方法完成基因注释并预测其功能，对galF和gnd基因进行遗传演化分析。结果显示鸡源鲍氏志贺菌O-抗原基因簇序列全长为12742 bp，其与人源鲍氏3型志贺菌和大肠杆菌O167的同源性最高，其核苷酸同源性分别为99.9％和99.8％;氨基酸同源性分别为99.9％和99.5％。共发现9个基因:吡喃型UDP-半乳糖变位酶基因(glf，1089 bp)、O-抗原转运酶基因(wzx，1266 bp)、O-抗原聚合酶基因(wzy，1251 bp)和糖基转移酶基因(orf3,1203bp; orf4,855bp; orf5,969bp; orf7,1092 bp; orf8,639 bp; orf9,633 bp)。研究表明人源鲍氏3型志贺菌可能由大肠杆菌O167进化而来，而鸡源鲍氏志贺菌可能来源于人源鲍氏3型志贺菌。
　　为获得高纯度的鸡鲍氏3型志贺菌脂多糖(LPS)及其亚单位O抗原多糖(O-PS)，采用改良热酚水法提取鸡源志贺菌的LPS，并联合使用葡聚糖凝胶层析得到高纯度的LPS;采用酸水解法联合葡聚糖凝胶层析获得高纯度的O-PS。PAGE银染结果显示LPS呈现不均一的梯形带，对提取物进行蛋白质和核酸含量测定显示所提纯LPS和O-PS纯度高，LPS蛋白含量仅为1.83％，O-PS蛋白含量仅为0.28％。本试验结果表明提取的LPS和O-PS可进行特异性研究及制备有效的候选疫苗。
　　为研究鸡源鲍氏志贺菌脂多糖(LPS)亚单位O-抗原多糖(O-PS)的特异性致病作用。采用改良热酚水法并联合葡聚糖凝胶层析得到高纯度的LPS;采用酸水解法联合葡聚糖凝胶层析获得高纯度的O-PS，对其进行体内外试验，观察其毒性作用并与LPS作对比。结果显示0.25～250μg/mL范围内的O-PS处理的Hela细胞组与对照组相比均有显著差异(P＜0.01)，表明鸡源鲍氏志贺菌O-PS对Hela细胞的增殖具有损伤作用，可引起Hela细胞病变，而LPS不能引起细胞病变;O-PS体内兔回肠襻试验中仅引起肠粘膜轻微出血;而LPS能引起回肠壁充血、水肿及化脓，对肠粘膜造成严重损伤。本研究表明鸡源鲍氏志贺菌LPS的亚单位O-PS具有细胞毒性作用，但其毒性表现不同于完整的LPS。

目录

声明

致谢

摘要

英文缩略表

文献综述

1 志贺菌的背景简介

1．1 志贺菌的病原学特性

1．2 志贺菌的流行病学

1．3 志贺菌的致病性

2 志贺菌脂多糖(LPS)的研究进展

2．1 LPS的结构组成

2．2 LPS的生物学功能

3 志贺菌O-抗原的研究进展

3．1 O-抗原的合成途径

3．2 O-抗原基因簇

结语

试验研究 试验一、鸡鲍氏志贺菌O-抗原基因簇的破译及遗传进化分析

引言

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果与分析

2．1 O-抗原全基因簇扩增结果

2．2 O-抗原基因簇的全基因序列测定

2．3 O-抗原基因簇全基因序列分析

2．4 单糖合成酶基因

2．5 糖基转移酶基因

2．6 寡糖单位处理酶基因

2．7 非编码区

2．8 galF基因和gnd基因的遗传进化分析

3 讨论

试验二、鸡鲍氏3型志贺菌脂多糖及O抗原多糖的提纯与鉴定

引言

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果与分析

2．1 鸡鲍氏3型志贺菌LPS产率

2．2 鸡鲍氏3型志贺菌LPS和O-PS多糖含量

2．3 鸡鲍氏3型志贺菌LPS和O-PS的PAGE银染

2．4 产物纯度检测

3 讨论

试验三、鸡源鲍氏志贺茵O-PS毒性作用的初步研究

引言

1 材料与方法

1．1 菌株

1．2 主要试剂

1．3 LPS和O-PS的制备

1．4 蒽酮-硫酸法测糖含量

1．5 LPS和O-PS的鉴定

1．6 产物纯度检测

1．7 鸡源鲍氏志贺菌LPS亚单位分子O-PS的体外毒性试验

1．8 鸡源鲍氏志贺菌LPS亚单位分子O-PS的体内毒性试验

1．9 石蜡切片的制作及HE染色

2．0 统计学处理

2 结果与分析

2．1 LPS和O-PS的体外毒性试验

2．2 LPS和O-PS的体内毒性试验

3．讨论

参考文献

已发表文章