基于小麦灌浆期热胁迫转录组分析及三个耐热相关基因的克隆、表达特征分析和遗传转化

摘要

本文基于小麦品种“中国春”“Triticum aestivumlL. Chinese Spring”灌浆期热胁迫下旗叶组织转录组分析，筛选得到2429个热胁迫应答候选基因，同时根据转录组分析结果，选定了2个受高温强烈诱导表达的基因TaG1和TaG12，以及1个受高温抑制表达的基因TaG16进行了深入研究，并通过RT-PCR技术克隆得到这3个基因的基因组序列和cDNA序列，并通过同源性氨基酸序列分析、组织表达和高温胁迫应答分析、植物表达载体构建和遗传转化等方法，以期从上述基因的角度探索高温胁迫下小麦的应答机制，并获得热胁迫相关优异基因资源，为小麦品种耐热性状改良提供指导和奠定基础。具体研究结果如下：
　　1.通过对小麦品种“中国春”灌浆期高温（38℃）8 h处理和适温（24℃）对照下旗叶组织样品转录组测序分析结果显示，对照及处理组有效序列标签（Clean tags）数目分别占总序列的百分比分别为96.74％和96.63%，并且对照和处理样品所检测到的基因数目已基本饱和，完全符合转录组测序分析需求；随后在完成样品转录组深度测序之后，对高温胁迫下小麦叶片组织中基因的高温应答情况进行分析结果显示，在检测到的93003个基因中有1058个基因属于热胁迫诱导上调类型，1371个基因转录表达受高温胁迫抑制。获得2429个热胁迫应答候选基因，为研究小麦耐热性机制获得了大量的优异基因资源。
　　2.根据转录组分析结果，初步选定了2个受高温诱导强烈表达的基因TaG1和TaG12，以及1个受高温抑制表达的基因TaG16进行了深入研究。核酸序列及氨基酸序列分析表明，小麦TaG1基因cDNA序列全长546 bp、基因组全长1071 bp、开放读码框420 bp、含有4个内含子、编码139个氨基酸、氨基酸序列与节节草、短柄草、水稻来源的PSII10kD叶绿体蛋白氨基酸序列相似性分别为100%、89%和83%，说明小麦TaG1基因表达蛋白属于植物PSII10kD叶绿体蛋白家族；小麦TaG12基因cDNA序列全长1297bp、基因组全长1297 bp、开放读码框972 bp、无内含子、编码323个氨基酸、氨基酸序列与水稻、山羊草来源的未知蛋白氨基酸相似性分别为66%和60%，小麦TaG12基因表达蛋白功能还未发现；小麦TaG16基因cDNA序列全长1220 bp、基因组全长1756 bp、开放读码框1083 bp、含有1个内含子、编码360个氨基酸、氨基酸序列与黑麦草、山羊草来源的咖啡酸-O-甲基转移酶蛋白相似性分别为83%和99%，说明小麦TaG16基因表达蛋白属于植物咖啡酸-O-甲基转移酶蛋白家族。组织表达分析表明，TaG1基因在“中国春”各组织的表达量强弱顺序分别为叶片、颖壳、茎、根和籽粒；TaG12基因的表达量强弱顺序为叶片、茎、籽粒、颖壳和根；TaG16基因的表达量强弱顺序为根、茎、颖壳、叶片和籽粒，显示出较强的组织特异性。高温胁迫应答分析表明，小麦TaG1和TaG12基因高温胁迫下转录本呈现上调表达模式，而TaG16基因的表达受高温抑制。
　　3.为深入研究这3个耐热候选基因的功能，通过构建植物表达载体并通过农杆菌介导拟南芥转基因技术遗传转化和种子萌发期热胁迫表型鉴定。结果表明，成功构建了3个超量植物表达载体pCAMBIA3301::TaG1、pCAMBIA3301::TaG12和pCAMBIA3301::TaG16。采用农杆菌介导法将上述基因导入野生型拟南芥品种“Col-o”，经特异性PCR鉴定及测序证实，外源目的基因已整合进入受体拟南芥基因组，并且分别获得转TaG1基因植株15株、转TaG12基因植株20株和转TaG16基因植株23株。种子萌发期高温（45℃）胁迫下萌发率分析表明，3个转TaG1基因拟南芥株系TaG1-1，TaG1-4和TaG1-7种子的萌发率与野生型“Col-o”萌发率间无显著性差异（P>0.05）；转TaG12基因的3个株系TaG12-2，TaG12-4和 TaG12-6拟南芥种子萌发率与野生型“Col-o”萌发率间差异显著（P<0.05）；转 TaG16基因3个株系TaG16-1，TaG16-3和TaG16-5拟南芥种子萌发率与野生型“Col-o”萌发率间差异显著（P<0.05）。说明转TaG12和TaG16基因拟南芥种子萌发期耐热性有所提高。，具体原因有待进一步验证。

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中文摘要

1 文献综述

1.1 高温胁迫对作物的影响

1.1.1 高温胁迫对作物种子萌发和植株生长的影响

1.1.2 高温胁迫对作物光合作用的影响

1.1.3 高温胁迫对作物生殖发育的影响

1.1.4 高温胁迫对作物产量和籽粒品质的影响

1.1.5 高温造成植物氧化胁迫反应

1.2 植物耐热性机制研究进展

1.1.6 植物逃避和耐受机制研究

1.2.2 植物抗氧化防御机制研究

1.1.7 植物热胁迫信号转导机制研究

1.1.8 外源保护剂与植物耐热性

1.1.9 分子生物技术在植物耐热性机制研究的发展

2 引言

3 材料与方法

3.1 小麦灌浆期热胁迫转录组分析

3.1.1 供试材料

3.1.2 转录组测序文库所需材料处理

3.1.3 Total RNA的提取

3.1.4 转录组测序数据分析

3.2 耐热候选基因的克隆及表达特性分析

3.2.1 试验材料

3.2.2 植物材料处理

3.2.3 总DNA的提取及纯化

3.2.4样品Total RNA的提取

3.2.5 cDNA第一链合成

3.2.6 耐热候选基因的克隆

3.2.7 目的片段的回收和连接转化

3.2.8 重组质粒的验证及序列测定

3.2.9 耐热候选基因组织特异性表达分析

3.2.10 耐热候选基因热胁迫应答表达分析

3.3 耐热候选基因遗传转化及热胁迫表型鉴定

3.3.1 供试材料

3.3.2 植物过表达载体构建

3.3.3 农杆菌感受态细胞的制备转化

3.3.4 根癌农杆菌介导拟南芥转化

3.3.5 转基因植株的筛选

3.3.6 转基因植株分子检测

3.3.7 转基因拟南芥萌发期耐热性分析

4 结果与分析

4.1 热胁迫转录组分析及耐热候选基因的筛选

4.1.1Total RNA的纯度分析

4.1.2 转录组测序数据质量评估分析

4.1.3 热胁迫转录组差异表达基因的筛选

4.2 耐热候选基因的克隆及表达特性分析

4.2.1 耐热候选基因的克隆及序列分析

4.2.2 小麦耐热候选基因氨基酸序列聚类分析

4.2.3 耐热候选基因组织特异性表达分析

4.2.4 耐热候选基因热胁迫应答表达分析

4.3 耐热候选基因功能验证

4.2.4 植物表达载体构建

4.3.2 根癌农杆菌介导拟南芥转化

4.3.3 转基因植株分子检测

4.3.4 转基因拟南芥萌发期耐热性分析

5 结论和讨论

5.1 热胁迫转录组分析及耐热候选基因筛选

5.2 耐热候选基因克隆及胁迫应答分析

5.3 耐热候选基因的功能验证

参考文献

英文摘要