绿茶茶多酚EGCG与肝细胞核受体FXRα/RXRα结合鉴定

摘要

乙型肝炎是由乙型肝炎病毒（HBV）引起的肝脏炎性疾病，在世界范围内广泛流行，感染HBV后后严重损害肝脏并引起其他器官损害及多种并发症。目前世界上乙型肝炎的主要治疗方法是抗病毒治疗。抗病毒治疗的关键在于抑制病毒的复制。实验研究表明HBV在人体内复制依赖于肝细胞中的肝富集转录因子，其中法尼醇X受体(FXR)和视黄醇X受体(RXR)与HBV病毒增强子二区和核心启动子（HBV ENⅡ&CP）复制转录有关系，进一步研究表明，FXR与RXR可以在被各自的配体激活后形成异物二聚体和HBV结合，调控HBV增强子二区和核心启动子的复制转录活性。FXR与RXR有望成为抑制HBV转录复制的新靶点。表没食子儿茶素没食子酸脂EGCG属于茶多酚的一种，占儿茶素中60％左右。近年来研究表明EGCG可以抑制HBV的转录复制，初步试验结果表明EGCG抑制HBV转录复制是通过结合FXRα、RXRα，调控其活性，抑制HBV转录复制。
　　本研究构建肝细胞核受体FXRα和RXRα的原核表达载体pET28a-FXRα/RXRα，并转入大肠杆菌BL21（DE3）中，加IPTG诱导重组蛋白表达，表达产物经Western Bloting鉴定确定为FXRα重组蛋白，纯化复性重组蛋白，免疫兔子制备多克隆抗体。同时构建肝细胞核受体 FXRα、RXRα真核表达载体 pcDNA3.1-FXRα、pcDNA3.1-RXRα及 pGL-3-HBV ENⅡ& CP Luciferase报告基因质粒，共转染 HEK293细胞，加入各自配体脱氧胆酸（Deoxycholic acid）、9-顺式维甲酸（9-cis）、或与EGCG共同作用细胞，读取细胞中荧光素酶的荧光值，分析FXR/RXR对HBV ENⅡ&CP的转录调控。结果显示：只有FXR与RXR共同被配体激活后联合上调HBV ENⅡ&CP的表达，EGCG可以抑制这一转录调控。
　　为进一步研究EGCG结合对象，采用氨基苯硼酸（PAB）琼脂糖亲和层析法分离EGCG结合蛋白，Western Bioting鉴定，结果显示FXRα/RXRα都与EGCG结合。DARTS（Drug affinity responsive target stability）实验：用热稳定的嗜热菌蛋白酶消化经EGCG处理/未经EGCG处理的细胞总蛋白，消化未与EGCG结合蛋白，Weatern Bloting实验鉴定蛋白。结果显示未消化蛋白为FXRα。因此，EGCG抑制HBV CP&ENⅡ转录复制，可能的途径是通过与FXRα结合，改变其分子构象，使其不能与HBV基因的转录调控元件结合，因而不能启动HBVCP&ENⅡ的转录复制。