猪圆环病毒2型病毒样颗粒性疫苗的制备与免疫评价

摘要

猪圆环病毒2型(Porcine Circovirus2，PCV2)与断奶仔猪多系统衰竭综(PostweaningmμLtisystemic wasting syndrome，PMWS)的发生密切相关，是其主要原发病原。PCV2还与猪皮炎肾病综合征、猪A2型先天性震颤、猪呼吸道病综合征等传染性疾病的发生相关。PMWS主要流行于5～18周龄的断奶仔猪，致死率较高，其临床症状主要呈现为:仔猪生长速率降低、体重减轻、呼吸急迫、皮炎、黄疸、淋巴结病变肿大等。PCV2在世界范围内的感染与流行，给养猪业造成了巨大的危害与经济损失。目前对PCV2的防控主要依靠疫苗，国内外也先后注册了全病毒灭活苗、重组嵌合苗和亚单位疫苗，在预防PCV2感染中发挥了重要作用。由于进口疫苗价格昂贵，而国产灭活疫苗效果仍不够理想，因而研制高效、廉价、安全的新型PCV2亚单位疫苗的需要已日益迫切。
　　基于PCV2结构蛋白(Capsid)能在体外自组装成病毒样颗粒(Virus-like particles，VLPs)的特性，我们采用大肠杆菌高密度发酵的方法对重组的Cap蛋白进行了可溶性表达，并纯化制备成病毒样颗粒，为新型PCV2 VLPs亚单位疫苗的研制奠定了基础，本研究主要分为以下几个部分:
　　(1)将含有pET28a-ORF2质粒的大肠杆菌菌株BL21DE3，进行了高密度发酵试验，并对发酵条件进行了摸索，建立了比较稳定的10L发酵罐体系，收获湿菌体量达93.9±1.9g/L;且得到的重组Cap蛋白以可溶形式存在，为重组Cap蛋白的纯化及PCV2疫苗的研制奠定了基础。
　　(2)将高密度发酵所得菌体进行高压均质破碎。所得上清用硫酸铵沉淀法进行初步除杂，然后采用IEC SP FF阳离子交换层析柱进行纯化，并对相应条件进行了摸索，得到相对纯度达85％以上的Cap蛋白，并对Cap蛋白体外组装病毒样颗粒(VLPs)条件进行了摸索，成功制备了与PCV2天然病毒结构相似的VLPs。
　　(3)建立评价PCV2 Cap蛋白体外稳定性的双抗夹心ELISA检测，使用该方法检测了不同贮存温度、不同反复冻融次数、不同保护剂等条件下Cap蛋白的活性变化。结果显示，Cap蛋白在25℃以下贮存时，其活性保持稳定;贮存时不同温度间变换对蛋白稳定性影响较大;在甘氨酸和甘油2种蛋白保护剂存在条件下蛋白活性的稳定性增强。
　　(4)利用高纯度Cap蛋白组装的VLPs作为抗原，分别免疫Balb/c小鼠和仔猪;通过检测抗体效价及动物的生产性能对疫苗免疫进行评价。小鼠免疫评价实验中，VLPs抗原分别与50V矿物油、IMS1313及卡波姆等佐剂按一定比例混合，制备PCV2重组VLPs疫苗;分别将生理盐水、勃林格猪圆环病毒2型疫苗分别设为阴性和阳性对照，对接种后12周内抗体效价进行检测与分析。结果显示，同种剂量情况下，油佐剂免疫效果与阳性对照组相当，抗体效价于第2周开始持续上升，并长期维持在较高水平，而水性佐剂表现较差。进行两次仔猪临床生产性能评价，每次选取150头仔猪，分为50V油佐剂疫苗注射组、生理盐水组、勃林格疫苗组，分别在15日龄注射1mL，记录生产性能。其中第一批免疫生理盐水组增重率高于勃林格疫苗组和50V油佐剂疫苗组，分别为200％、189％、180％，疫苗免疫效果不理想;而在第二批免疫中勃林格疫苗组和50V油佐剂疫苗组增重率高于生理盐水组，分别为296％、304％、252％;表明配制的重组VLPs油佐剂亚单位疫苗有相对较好的免疫效果。
　　本研究的意义在于成功建立了能够可溶表达PCV2重组Cap蛋白的大肠杆菌高密度发酵体系;纯化制备纯度较高的Cap蛋白，并对其进行了外稳定性进行了探索，且成功制备出了PCV2的VLPs;将所得VLPs与各类佐剂配合制成了不同的亚单位疫苗，并对其免疫效果进行了评价分析，最终确定50V油佐剂疫苗具有良好的免疫效果，为PCV2亚单位疫苗的开发奠定了基础。

目录

声明

致谢

摘要

第一部分 文献综述

1 猪圆环病毒研究进展

1．1 猪圆环病毒的发现及分类学地位

1．2 猪圆环病毒的理化及增殖培养特性

1．3 猪圆环病毒的基因序列特征

1．4 猪圆环病毒基因组编码的相关蛋白

1．5 PCV2相关疾病及致病机理

1．6 PCV2流行病学

1．7 猪圆环病毒疫苗研究进展

2 大肠杆菌高密度发酵研究进展

2．1 大肠杆菌高密度发酵影响因素

3 重组蛋白纯化方法的研究进展

3．1 离子交换层析

3．2 疏水层析

3．3 反向层析

3．4 亲和层析

3．5 凝胶过滤层析

4 病毒样颗粒疫苗研究进展

5 本研究的目的和意义

第二部分 研究内容

第一章 猪圆环病毒2型Cap蛋白的高密度发酵表达

1 引言

2 材料与方法

3 结果与分析

4 讨论

第二章 重组猪圆环病毒2型Cap蛋白纯化及其VLPs的体外组装

1 引言

2 材料与方法

3 结果与分析

4 讨论

第三章 重组猪圆环病毒2型Cap蛋白体外稳定性研究

1 引言

2 材料与方法

3 结果与分析

4 讨论

第四章 猪圆环病毒2型病毒样颗粒性疫苗的动物免疫评价

1 引言

2 材料与方法

3 结果与分析

4 讨论

全文总结

参考文献