糙皮侧耳产孢相关基因stpo1的克隆及表达分析

摘要

糙皮侧耳（P.ostreatus）是我国栽培量最广、消费量最大的食用菌。糙皮侧耳子实体成熟过程中会弹射大量孢子，数量巨大的孢子不仅会降低子实体的品质，还会引起菇农的―蘑菇肺‖。选育无孢糙皮侧耳菌株对解决孢子引起的过敏反应具有重要作用。
　　本文将肺形侧耳（Pleurotus pulmonarius）产孢相关基因stpo1的基因序列，与糙皮侧耳转录组数据库进行比对，得到糙皮侧耳中与其同源的基因，并将获得的基因命名为stpo1。通过反转录PCR（RT-PCR）的方法，克隆得到了stpo1的CDS全长序列；对目的基因进行了生物信息学分析；在转录水平对stpo1进行表达模式分析；利用pEASY-E2原核表达系统对stpo1进行原核表达；构建了糙皮侧耳stpo1过表达以及RNA干扰表达载体，以期通过对stpo1基因过表达或者沉默来研究stpo1基因与糙皮侧耳孢子形成的关系。本文主要研究结果如下：
　　1、以糙皮侧耳子实体为材料，采用反转录PCR技术克隆出糙皮侧耳产孢相关基因stpo1的CDS区（长度为2,556bp）；并以基因组为模板克隆出该基因的gDNA（长度为3,853bp）。Genbank登录号为KR822419。对其基因结构进行分析，发现该基因拥有25个内含子。stpo1与stpp1、PC9v1.0同源基因、PC15v2.0同源基因的CDS区核酸序列比对结果显示，stpo1与上述三个同源基因分别具有88％、97%、99%的一致性。
　　2、STPO1蛋白的结构预测结果显示，该蛋白属于DNA错配修复MSH家族基因，具有该家族蛋白中典型的MutS结构域、ATP结合位点、P-Loop。STPO1蛋白的GO功能分析显示，STPO1蛋白具有DNA错配修复的功能，能够在ATP供能的情况下，识别并结合DNA错配位点，然后对其进行修复。产孢相关蛋白主要通过维持减数分裂的正常进行来参与担孢子的形成，但功能预测结果并未显示STPO1具有这方面的功能。
　　3、通过实时荧光定量PCR（RT-qPCR）分析了糙皮侧耳stpo1的表达模式。结果显示，stpo1基因在子实体成熟期的表达量最高，在其他时期基本不表达；且其在成熟子实体菌褶中的表达量远高于菌柄和菌肉中的表达量，在菌柄和菌肉中基本不表达。以上结果说明：stpo1基因只在糙皮侧耳成熟子实体的菌褶中特异表达，由此表明stpo1基因可能与糙皮侧耳的孢子形成有一定的关系。
　　4、采用pEASY-E2原核表达系统对stpo1进行了原核诱导表达，成功获得了与分子量预测结果相符的融合蛋白STPO1（大小约为94kDa），进一步证明本文成功克隆获得了stpo1基因的完整编码区，为后续研究糙皮侧耳的DNA错配修复以及减数分裂的分子机制奠定了一定基础。
　　5、在双元表达载体pCAMBIA1300的基础上将潮霉素抗性基因上游的CaMV35S启动子更换为糙皮侧耳的gpd启动子，以提高潮霉素抗性基因在糙皮侧耳中的表达量。将stpo1基因的CDS区连入另外一个gpd启动子的下游，成功构建了stpo1基因过表达载体；同时将stpo1的发卡结构连入gpd启动子的下游，成功构建了RNA干扰载体，为stpo1基因的体内功能验证奠定了基础。

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中文摘要

1 文献综述

1.1糙皮侧耳概述

1.2糙皮侧耳无孢子突变株的育种研究

1.3 真菌减数分裂基因的研究进展

1.4侧耳属产孢相关基因的研究

1.5 真菌遗传转化系统研究

2 引言

3 糙皮侧耳中产孢相关基因stpo1部分片段的克隆与分析

3.1 实验材料

3.2 实验方法

3.3 结果与分析

3.4本章小结

4 糙皮侧耳产孢相关基因stpo1的克隆及生物信息学分析

4.1 实验材料

4.2 实验方法

4.3 结果与分析

4.4 本章小结

5 stpo1基因的表达模式分析与原核表达验证

5.1 实验材料

5.2 实验方法

5.3 结果与分析

5.4 本章小结

6 根癌农杆菌介导的糙皮侧耳遗传转化

6.1 实验材料

6.2 实验方法

6.3 结果与分析

6.4 本章小结

7 结论与讨论

7.1 主要结论

7.2 讨论

7.3 展望

参考文献

英文摘要