部分链格孢属真菌的形态学及多基因鉴定

摘要

在世界范围内，链格孢属真菌是引起农作物发病的重要病原菌，特别是其中的大孢子种，可引起许多重要作物黑斑病，造成巨大的经济损失。而链格孢属的分子分类鉴定研究还不完善，本研究主要对链格孢属大孢子种进行收集及鉴定，深入了解链格孢属真菌的存在状况，发现更多的链格孢属大孢子种新种资源，为今后相关真菌分类及病害研究奠定基础。本研究从云南的大理、昆明、西双版纳，青海西宁，甘肃兰州、渭源会川，陕西西安，河南郑州、灵宝、郏县等地采集了1000余份植物病害标本，并进行分离培养，共得到链格孢小孢子种117株，链格孢大孢子种8株。整理实验室保存链格孢大孢子种17株，共计25株，进行形态学鉴定。将25株链格孢大孢子种鉴定到种的21株，鉴定结果为：ZMJ30为百日菊链格孢A.zinniae、ZMJ73为胡萝卜生链格孢A.daucicola、ZMJ72为人参链格孢A.panax、ZMJ10为雪叶莲链格孢A.cinerariae、ZMJ81为车前链格孢A.plantaginis、ZMJ80为A.ranunculi、ZM140768-1为大孢链格孢A.macrospora、ZM140773为侵染向日葵链格孢A.helianthinficiens、ZM131190为向日葵链格孢A.helianthi、ZM141147为万寿菊链格孢A.tagetica、ZM140227为万寿菊生链格孢A.tageticola、ZM141179为胡萝卜链格孢A.dauci、ZM12272-1为葱链格孢A.porri、ZM140831为芸薹链格孢A.brassicae、ZM030316为鬼针草链格孢A.pilosa、ZM030296为蒺藜链格孢A.tribuli、ZM030201为葎草链格孢A.humuli-scandens、ZM160038为茄链格孢A.solani、ZM160039为大孢链格孢A.macrospora、726546和726547均为蜂斗菜链格孢A.petasitis；ZMJ76、ZM12268-a、ZM12260-b、ZM12250-a这4个为未知种。其中，共发现新种3个，即车前链格孢A.plantaginis、万寿菊生链格孢A.tageticola、鬼针草链格孢A.pilosa。证明新病害2个，即大孢链格孢A.macrospora引起西红柿叶斑病，雪叶莲链格孢A.cinerariae引起蜂斗菜叶斑病。
　　从真菌分类研究中常用的基因ITS、EF-1α、HIS、RPB2、ACT、OPA2、APN2、Gpd中，根据扩增率和扩增产物是否单一，即琼脂糖凝胶电条带是否单一，来判断某一个基因是否是个链格孢大孢子种的分子鉴定。最终筛选出来5个扩增率较高，条带单一的基因，即ITS、EF-1α、HIS、RPB2、ACT。扩增出的目的片段大小依次为：573bp、339bp、426bp、951bp、436bp。
　　参试的链格孢大孢子种共计21个，基于ITS、EF-1α、HIS、RPB2、ACT这5个基因的序列，并下载链格孢属相关的基因序列，用MEGA6.06的最大似然法（Maximum likelihood estimate）分别进行系统发育树的构建。利用计算机的cmd命令调用相关软件在对每一个菌株的5个基因序列进行拼接，将拼接好的序列同样用MEGA6.06的最大似然法（Maximum likelihood estimate）进行系统发育树的构建。
　　对系统进化树分析后发现，ACT基因的保守性最强，对链格孢大孢子种的区分度比较小，只能将大孢子种和小孢子种明显区分成两个部分，将菌株ZMJ72鉴定为人参链格孢A.panax，将ZM160038鉴定为茄链格孢A.solani，而其他大孢子菌株都无法鉴定到种。ITS基因也相对较为保守，只能把大孢子种和小孢子种分成两个独立的部分，将菌株菌株ZMJ72鉴定为人参链格孢A.panax。EF基因的保守性最弱，外群和小孢子种聚合在一起，证明，虽然EF基因的扩增率较高，条带单一，但是扩增出的片段大小不一，比对及建树后发现EF基因不适合作为链格孢属分类鉴定的参考基因。HIS基因也相对较为保守，不能将大孢子种和小孢子种明显区分开。RPB2基因在链格孢属分类鉴定中的表现相对较好，不仅能够将大孢子种和小孢子种区分开，还能将菌株ZM141179为胡萝卜链格孢A.dauci，ZMJ72为人参链格孢A.panax。多基因聚合后建树之后，总体来说，多基因聚合鉴定比单基因鉴定更加有效，能够将多数种区分开，但是仍有部分种不能有效区分，这部分种需进一步研究鉴定到种。

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1 文献综述

1.1 链格孢属真菌的研究概况

1.1.1链格孢属真菌的经济重要性

1.1.2链格孢属真菌的研究发展历史

1.1.3链格孢属真菌大孢子种的国内外研究进展

1.2 现代分子分类技术在真菌分类中的应用

1.2.1核糖体基因（rDNA）

1.2.2延伸因子基因（tef-1α）

1.2.3 组蛋白基因（Histone,HIS）

1.2.4 RNA聚合酶Ⅱ第2大亚基基因（RPB2）

1.2.5 肌动蛋白基因（Actin,ACT）

1.2.6 微管蛋白基因（β-tubulin）

1.2.7甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因（gpd）

1.2.8 氨肽酶N基因（APN2）

1.2.9基因组匿名区域（OPA2）

1.3 其他技术在链格孢属真菌分类中的应用

1.3.1 数值分类法

1.3.2 化学分类法

2 引言

3 材料与方法

3.1 链格孢属真菌的形态鉴定

3.1.1 实验材料

3.1.2 实验方法

3.2 链格孢属真菌的多基因系统学研究

3.2.1 DNA的提取

3.2.2 PCR扩增引物

3.2.3 PCR扩增程序循环设置

3.2.4 PCR反应体系

3.2.5 PCR扩增产物的纯化及检验

3.2.6 DNA序列的测定

3.2.7 DNA核苷酸序列分析及系统发育树的构建

4 结果与分析

4.1 部分链格孢小孢子种的分离及形态鉴定

4.1.1 长链型小孢子种链格孢

4.1.2 短链型小孢子种链格孢

4.2 链格孢大孢子种的分离及形态鉴定

4.2.1 Alternaria tribuli 蒺藜链格孢

4.2.2 Alternaria humuli-scandens葎草链格孢

4.2.3 Alternaira helianthi向日葵链格孢

4.2.4 Alternaria helianthinficiens侵染向日葵链格孢

4.2.5 Alternaria tagetica万寿菊链格孢

4.2.6 Alternaria dauci胡萝卜链格孢

4.2.7 Alternaria brassicae芸薹链格孢

4.3 新病害记录种及新种

4.3.1 新病害记录种

4.3.2 新种

4.4 链格孢大孢子种上基因的筛选及评价

4.4.1 基因的筛选

4.4.2 基因的评价

4.5 供试链格孢大孢子种的系统发育分析

4.5.1 供试菌株来源及本GenBank接受号

4.5.2 基于ITS基因构建的系统发育树

4.5.3 基于EF-1α基因构建的系统发育树

4.5.4 基于HIS基因构建的系统发育树

4.5.5 基于RPB2基因构建的系统发育树

4.5.6 基于ACT基因构建的的系统发育树

4.5.7 多基因聚合构建的系统发育树

5 结论与讨论

5.1 链格孢属真菌的收集及大孢子种的形态学鉴定

5.2 基因的筛选及评价

5.3 链格孢属大孢子种的分子鉴定及多基因分析

5.4 形态学鉴定、单基因分子鉴定及多基因聚合鉴定的评价

参考文献

英文摘要