基于“代谢组学”分析烟草多酚类物质对光质的响应

摘要

多酚类化合物是烟草重要的内源代谢物，其在烟草内的生物合成与积累受环境因素的调控。为了分析烟草多酚类物质对光质条件的响应。本研究利用不同颜色的薄膜覆盖改变光质，用高光谱测量仪记录光谱变化，分析不同薄膜覆盖下光质和光强的差异。并以云烟87为实验材料，利用代谢组学方法（包括靶向代谢组学和非靶向代谢组学）研究烟草代谢物在不同光质条件下的差异，最后利用数量生态学方法分析光质对烟草代谢物的影响。试验的主要结果如下:
　　(1)不同颜色薄膜对自然光的吸收波段不同，从而造成了光强和光质两方面的差异。不同颜色薄膜覆盖形成了光质（光谱波段）和光强的梯度差异，并且方差分析发现各光谱波段和光强在处理间均具有显著性差异。而温湿度在各处理间没有显著差异。所以不同处理间烟草代谢物的变化主要是由光强和光质引起的变异。
　　(2)利用UHPLC-QTOF靶向代谢组学方法在烟叶提取物中共检测到10种绿原酸异构体，包括位置异构和顺反异构体。其中cis-3，5-diCQA和cis-4CQA在烟草中首次被检测。10种绿原酸在不同光质处理下有4种积累模式，其中cis-3-CQA和trans-3-CQA的积累模式相同，trans-4-CQA、trans-5-CQA、cis-4-CQA和cis-5-CQA的积累模式相似，cis-3，5-diCQA和trans-3，5-diCQA的积累模式一致，另外3，4-diCQA和4，5-diCQA的积累模式相似。并且聚类热图显示cis-3-CQA、trans-3-CQA、cis-3，5-diCQA和trans-3，5-dieQA受光质的影响一致，而其余6种绿原酸异构体受光质的影响相同，推测10种绿原酸异构体存在4种生物合成机理，分布于2条代谢途径上。另外，从烟叶提取物中检测到了3种阿魏酰奎宁酸、6种对香豆酰咖啡酸和一种咖啡酰莽草酸，以及12种黄酮类化合物。12种黄酮化合物根据母核的不同可以分为Kaempferol衍生物、Quercetin衍生物、Myricetin衍生物和cyanidin衍生物，而根据母核所连基团的不同还可以分为黄酮甲基衍生物和黄酮糖苷衍生物两类。三种黄酮甲基衍生物在不同光质处理下的积累模式相似，而另外9种黄酮糖苷衍生物的积累模式一致。黄酮甲基衍生物均是受远红光的正调控，而受紫外光波段的负调控。相反，黄酮糖苷衍生物受远红光的负调控。黄酮甲基衍生物在植物体内的生物合成受黄酮甲基转移酶的催化，而黄酮糖苷衍生物受黄酮糖苷转移酶的调控。推测编码这两种酶的基因受光质的调控不同，说明这两个基因存在受光调控不同的启动子。
　　(3)为了分析光质与多酚化合物积累的关系，利用逐步回归构建多酚化合物与光谱波段之间的回归方程，回归方程均达到了极显著水平。然后利用sobol全局敏感性分析确定每种多酚化合物最敏感的光谱波段，并构建多酚化合物含量与最敏感光谱波段的回归方程，多酚化合物含量与最敏感光谱波段之间存在明显的线性关系。并利用第二年数据对回归方程进行验证发现均方根误差均小于0.4。
　　(4)利用UHPLC-QTOF非靶向代谢组学方法对烟草叶片提取物进行代谢轮廓分析，超高效液相15min梯度条件能够有效的分离烟草代谢物，并且正离子模式和负离子模式下均能够提取超过2900个物质峰。PCA分析发现成熟期和衰老期的烟叶受光质影响大于旺长期和现蕾期的烟叶。分析处理与对照间的物质变化发现:覆盖薄膜能够引起烟草多数代谢物含量的增加（薄膜处理相对于自然光处理的差异倍数大于1）。烟草生长前期（现蕾期之前）不同光质处理间的差异代谢物较少，而现蕾期及其之后时期的差异代谢物数量较多，其中现蕾期的差异代谢物数量最多。利用高分辨质谱共鉴定了61种差异代谢物，主要包括多酚、酯类、萜类以及甾醇类化合物，其中多酚类化合物有25种，酯类化合物有20种。通过多酚代谢网络分析发现现蕾期之前受光质影响的多酚类物质主要为苯丙烷类化合物，而现蕾期之后受光质影响的黄酮类化合物逐渐增多。
　　(5)烟草代谢受光强和光质的共同影响，偏冗余分析结果显示光质对烟草代谢物的影响远远大于光强的影响。根据光谱波段对烟草代谢的生态作用，日光光谱可以划分为紫外至蓝光波段(UV-B;350-490nm)、绿光至黄光波段(G-Y;490-600nm)、黄红光波段(YR;600-610nm)、红光波段(R;610-710nm)、远红光至近红外波段(FR-NIR;710-2200nm)五个生态波段，这为进一步分析光质影响植物代谢奠定了基础。并且FR-NIR波段对烟草代谢的影响作用于UV-B波段的作用相反。

目录

声明

致谢

摘要

第一章 研究背景

1 烟草及烟草代谢物

2 植物代谢物受环境的影响

2．1 气候条件对植物代谢物的影响

2．2 生物、非生物逆境对植物代谢物的影响

3 光对植物生长及代谢的影响

4 代谢组学及其研究方法

4．1 核磁共振技术

4．2 质谱及其联用技术

4．3 其他代谢组学平台

5 烟草代谢组学研究进展

5．1 代谢组学分析不同地理来源烟叶的差异

5．2 代谢组学分析生物、非生物胁迫对烟草的影响

6 本研究的目的和意义

第二章 不同颜色薄膜覆盖处理的环境分析

2．2 实验处理

2．3 温湿度及光谱数据测量

2．4 数据处理

3 结果与分析

3．1 光谱曲线分析

3．2．不同处理光强分析

3．3．不同处理光质分析

3．4．不同处理光质的聚类分析

3．5．不同处理温湿度分析

4．结论与讨论

第三章 靶向代谢组分析光质对烟草多酚代谢的影响

1 引言

2 材料与方法

2．1 仪器与化学试剂

2．2 试验处理和样品采集

2．3 光质数据测量

2．4 物质提取

2．5 LC-MS／MS条件

2．6 多酚物质鉴定

2．7 多酚物质定量

2．8 数据分析

3 结果与讨论

3．2 多酚代谢物的鉴定

3．3 已鉴定多酚物质的含量及代谢机理分析

3．4 多酚物质与光质的关系

3．5 影响多酚类物质积累的光谱波段分析

4 结论与讨论

4．1 结论

4．2 讨论

第四章 非靶向代谢组学分析光质对烟草代谢的影响

1 引言

2．材料与方法

2．1 仪器与化学试剂

2．2 试验处理和样品采集

2．3 光质数据测量

2．4 物质提取

2．8 差异代谢物的鉴定

2．9 差异代谢物生态分析

2．10 代谢网络分析

3 结果与分析

3．1 数据采集分析

3．2 光质处理间PCA分析

3．3 差异代谢物的选取

3．4 差异代谢物鉴定

3．5 代谢网络分析

3．6 光质对烟草代谢物的影响

3．7 光质调控代谢网络分析

4 结论与讨论

4．1 结论

4．2 讨论

参考文献

附录