抗H9N2亚型禽流感X-19流行株单克隆抗体的制备与鉴定

摘要

禽流感（Avian Influenza,AI）是由A型流感病毒引起的主要感染禽类的传染病，可分为低致病性禽流感和高致病性禽流感。以H9N2亚型禽流感为代表的低致病性禽流感，发病后致死率低，但感染后往往引起免疫力下降，易产生继发感染导致生产性能降低，因此它对养禽业造成的经济损失相当严重。现存的H9N2亚型禽流感诊断方法主要为传统的病原学分离、血清学和RT-PCR诊断等，但因为耗时较长，对仪器设备要求较高等而不利于现场快速诊断。本研究的目的是制备出抗H9N2亚型禽流感病毒X-19流行株的单克隆抗体，为H9N2亚型禽流感的快速诊断和研究奠定基础。
　　实验采用了H9N2亚型禽流感病毒X-19株作为抗原来制备单克隆抗体。将H9N2亚型禽流感病毒X-19株接种SPF鸡胚尿囊腔，传代至第三代，收获X-19株禽流感病毒，测定HA效价为10log2。使用差速离心方法浓缩病毒，使X-19病毒的HA效价从10log2增加到13log2。用蔗糖密度梯度离心法纯化病毒，可见病毒亮带出现在蔗糖密度30％与60%之间。
　　将浓缩的X-19病毒灭活，与佐剂混合后，按免疫程序接种6周龄的Balb/c小鼠。使用纯化的X-19病毒为包被抗原，以确定的最佳包被浓度、最佳反应时间等建立间接ELISA方法，测定小鼠的血清抗体水平。当小鼠抗体水平超过1:102400时，采集小鼠脾细胞，与小鼠骨髓瘤NS0细胞进行细胞融合。使用已建立的ELISA方法对阳性孔进行筛选，阳性孔的细胞通过3次有限稀释亚克隆后，得到6株能稳定分泌抗H9N2亚型禽流感病毒X-19株的杂交瘤细胞株，分别命名为1A7、2B11、2C9、8F3、4F3、3B9。
　　使用ELISA和HI实验分别检测6株杂交瘤细胞的上清和腹水，除了2C9外，其余的5株杂交瘤细胞HI值均高于6log2，腹水HI效价值高于8log2，ELISA方法检测的细胞上清效价在1:800~1:6400之间，腹水的效价在1:3200~1:51200之间。
　　对单克隆抗体进行特异性鉴定，结果表明，它只与禽流感H9N2亚型X-19株反应，不与IBDV、SIV、NDV、FADV、IBDV反应，说明制备的单克隆抗体特异性高。将6种单抗与6株不同H9亚型禽流感病毒反应，发现8F3与4株H9亚型禽流感病毒反应呈阳性，可以初步判定其反应谱较广，推测其特异性识别H9亚型禽流感病毒的某个保守位点，有待进一步试验验证。间接荧光实验可见6株单抗均有较亮的免疫荧光，具有较好的免疫活性，具备制成H9亚型禽流感病毒快速检测试剂盒的潜力。

目录

封面

声明

致谢

目录

中文摘要

符号说明

1 文献综述

1.1 禽流感概述

1.2 禽流感分类及命名

1.3 H9亚型低致病性禽流感的危害

1.4 H9N2亚型禽流感病毒的变异特性

1.5 H9亚型低致病性禽流感的流行病学

1.6 禽流感病毒的病原学特征

1.7 禽流感病毒的检测方法的研究

1.8 单克隆抗体技术的研究进展

2 引言

3 材料和方法

3.1 材料

3.2 方法

3.3 单克隆抗体的鉴定

4 结果和分析

4.1X-19 株禽流感病毒抗原的制备

4.2 间接ELISA方法的初步建立

4.3 杂交瘤细胞的筛选

4.4 单克隆抗体的鉴定

5 结论与讨论

参考文献

英文摘要