鸭源鸡杆ompW基因对菌体抗逆和致病性的影响机制及flfA基因突变菌株的构建

摘要

鸭源鸡杆菌（Gallibacterium anatis，G.anatis）是一种革兰氏阴性菌，为巴氏杆菌科鸡杆菌属的代表种。鸭源鸡杆菌感染蛋鸡后往往造成以腹膜炎和输卵管炎为主的病理变化，导致蛋鸡产蛋量下降、死亡率升高。该菌的多重耐药性使得抗生素治疗鸭源鸡杆菌病的效果不甚理想。用目前部分已知致病因子作为抗原的传统疫苗均无法提供理想的保护效果。新型疫苗的研制是当前鸭源鸡杆菌病防控研究的重点，而鸭源鸡杆菌致病因子及致病机理的研究和鉴定是迫切需要解决的关键问题。
　　外膜蛋白W(Outer membrane proteinW，OmpW)在革兰氏阴性菌生物被膜形成、黏附、耐应激中发挥重要作用;菌毛通常在细菌黏附宿细中发挥关键作用。但这两个因子在鸭源鸡杆菌的具体作用还未被阐明。为了解OmpW及菌毛在鸭源鸡杆菌各种生物学功能中的作用，进一步阐明该菌的致病机理，本研究进行了以下几个方面的研究。主要研究结果报告如下:
　　1.鸭源鸡杆菌ompW缺失菌株ΔompW的构建及生物学特性研究
　　鉴于外膜蛋白在革兰氏阴性细菌的黏附、抗应激、耐药等各种生物学功能中发挥重要作用，本研究利用M-Ⅳ培养基制备鸭源鸡杆菌感受态细胞，用自然转化法将上下游同源臂和氯霉素抗性基因组构成的线性打靶序列转化鸭源鸡杆菌感受态细胞，PCR和Western Blotting鉴定表明成功构建了ompW缺失菌株ΔompW。然后比较了鸭源鸡杆菌RZ和ΔompW的生长性能及溶血活性，发现ompW缺失对鸭源鸡杆菌的生长速度、菌落形态大小及溶血活性没有影响，表明OmpW不参与鸭源鸡杆菌的这些生物学特性。最后应用微量稀释法测定了12种抗菌药物对鸭源鸡杆菌RZ和ΔompW的MIC，结果显示相比鸭源鸡杆菌亲本菌株，ΔompW对土霉素和四环素的敏感性显著提高(p＜0.01)，二者的MIC值分别降低了8(128/16)和32(128/4)倍，表明OmpW在鸭源鸡杆菌抗四环素类药物中发挥重要作用。
　　2.RZ和ΔompW的抗应激研究
　　在构建ΔompW的基础上，分析了鸭源鸡杆菌RZ和ΔompW在不同NaCl浓度培养基中的生长情况，并用SDS-PAGE和Western Blotting分析鸭源鸡杆菌外膜蛋白的表达水平，最后用RT-qPCR分析了不同盐度下鸭源鸡杆菌OmpW mRNA的转录水平的差异。结果显示在高盐培养基(3％NaCl)中两者的对数期推迟，生长均受到影响，但RZ的生长速度高于ΔompW的生长速度;随着培养时间时间增加，ΔompW的生长受到的影响更大。表明RZ比ΔompW更耐受高渗透环境，ΔompW的生长受高渗透环境影响更大。与正常BHI培养时相比，RZ在高NaCl含量BHI培养时OmpW的表达被上调，与此对应的是鸭源鸡杆菌也上调了OmpW mRNA的转录水平，提示OmpW可能在鸭源鸡杆菌抵抗渗透应激中发挥一定作用。在热应激、渗透压力及氧化应激环境下，ΔompW均低于RZ对应激的抵抗率，表明OmpW与抗应激能力有一定的相关性。
　　3.RZ和ΔompW抗血清杀菌机制研究
　　本研究分析了RZ和ΔompW在血清含量不同的培养基中的生存率，随后用Western Blotting和RT-qPCR分别分析了两者在不同血清浓度下的OmpW表达水平及其mRNA转录水平。结果表明RZ和ΔompW在低浓度血清中的生存率差别不显著(p＞0.05)，随着血清含量增加，ΔompW的生存能力逐渐低于RZ的生存能力;该结果提示OmpW可能在鸭源鸡杆菌抗血清杀菌活性中发挥重要作用。为进一步阐明鸭源鸡杆菌OmpW在抵抗补体杀菌活性中的作用，笔者将RZ与鸡正常血清或热灭活血清一起孵育，用Western Blotting方法分析了OmpW的变化。与对照组相比（灭活血清处理），细菌用鸡正常血清处理后其OmpW的表达及其mRNA的转录升高;上述结果表明OmpW与该菌抵抗补体介导的杀菌活性有关。
　　为初步探索鸭源鸡杆菌抵抗补体杀菌的通路，将RZ和ΔompW分别与鸡血清+EDTA（抑制所有补体通路）或血清+EGTA-Mg2+（仅允许补体旁路通路激活）。结果显示EDTA存在时，两株细菌的生存率几乎没有差异，而且与对照组细菌的生存率相似;血清中加入EGTA-Mg2+时，两株细菌的生存率均降低，说明补体旁路通路介导了补体杀菌活性;血清中加入EGTA-Mg2+时，ΔompW的生存率明显低于RZ的生存率(p＜0.05)。这些结果提示OmpW通过抑制旁路通路发挥抗补体杀菌活性。
　　4.RZ和ΔompW致病性的研究
　　分析了RZ和ΔompW对小鼠的半数致死量(Median lethal dose，LD50)及小鼠感染后的生存能力。结果显示RZ和ΔompW对小鼠LD50分别为2.93×108CFU和4.08×108CFU;相对于RZ，ompW缺失使ΔompW对小鼠的LD50提高;-ΔompW感染组小鼠的生存率高于RZ感染组小鼠的生存率，两组小鼠在临床症状上没有眼观差异;小鼠的病理变化主要包括肠道肠壁变薄且透明，肠、肺脏、肝脏和脾脏出血，但两组小鼠的病理变化无肉眼可见差异。上述结果表明ompW缺失导致鸭源鸡杆菌对小鼠的致病力有降低，但差异很小。
　　随后测定了RZ和ΔompW生物被膜形成能力和对鸡原代输卵管上皮细胞的黏附性能，结果显示二者形成生物被膜能力均较弱，无显著差异(p＞0.05);两者黏附鸡原代输卵管上皮细胞的数量随着孵育时间增加而增加，ΔompW的黏附数量低于RZ的黏附数量，但差异不显著(p＞0.05)。上述结果表明OmpW参与了鸭源鸡杆菌对鸡原代输卵管上皮细胞的黏附，对生物被膜形成影响很小。
　　5.鸭源鸡杆菌菌毛结构蛋白缺失菌株ΔflfA的构建及生物学特性研究
　　利用上述自然转化法，用上下游同源臂和氯霉素抗性基因构成的线性打靶片段转化鸭源鸡杆菌感受态细胞，PCR和Western Blotting鉴定阳性转化子，结果显示突变菌株不表达菌毛结构蛋白，成功构建了菌毛结构蛋白缺失菌株ΔflfA;随后分析了鸭源鸡杆菌RZ和ΔflfA的生长性能和鸡原代输卵管上皮细胞黏附性能。结果显示FlfA的缺失没有影响鸭源鸡杆菌的生长性能和菌落形态;RZ和ΔflfA对鸡原代输卵管上皮细胞的黏附数量随孵育时间的增加而增多，而FlfA的缺失使ΔflfA的黏附数量显著低于RZ的黏附数量(p＜0.05)。表明F17样菌毛蛋白在鸭源鸡杆菌黏附鸡原代输卵管上皮细胞中发挥关键作用。
　　综上所述，作者用自然转化法成功构建了鸭源鸡杆菌突变菌株ΔompW和ΔflfA，不仅为OmpW和FlfA功能研究奠定了良好的基础，而且为该菌其它基因的研究将提供了可靠的技术平台。OmpW在鸭源鸡杆菌抗四环素类药物中发挥重要作用;OmpW在鸭源鸡杆菌适应不同钠离子浓度中发挥重要作用，且与鸭源鸡杆菌耐受热应激和氧化应激有一定相关性;OmpW通过抑制补体旁路通路发挥抗血清杀菌活性;OmpW与鸭源鸡杆菌对小鼠的致病力及对鸡原代输卵管上皮细胞黏附性能下降有一定的相关性;F17菌毛在鸭源鸡杆菌黏附鸡原代输卵管上皮细胞中发挥关键作用。

目录

声明

致谢

摘要

文献综述

1 鸭源鸡杆菌

1．1 病原学

1．2 禽类鸭源鸡杆菌感染现状

1．3 鸭源鸡杆菌种群演化动态

1．4 鸭源鸡杆菌的传播途径

1．5 鸭源鸡杆菌的致病性

1．6 临床症状及病理变化

1．7 分子生物学检测诊断方法

2 鸭源鸡杆菌毒力因子及其致病机理研究进展

2．1 菌毛

2．2 荚膜

2．3 生物被膜

2．4 外膜囊泡

2．5 RTX样毒素GtxA

2．6 金属蛋白酶

2．7 血凝素

2．8 耐药因子

3 细菌外膜蛋白W的研究进展

3．1 概述

3．2 增强细菌环境适应能力

3．3 参与耐药·眭的形成

3．4 具有免疫原-性

3．5 与细菌致病性相关

3．6 抵抗宿主天然免疫防御

本研究目的和意义

第一部分 鸭源鸡杆菌ompW基因缺失株的构建及生物学特性分析

1 引言

2．1 菌株与质粒

2．2 培养基及主要试剂

2．3 主要仪器

2．4 主要培养基及溶液的配制

2．5 方法

3 结果与分析

3．1 扩增出ompW基因上下游同源臂及Cmp抗性基因

3．3 鸭源鸡杆菌突变株ΔompW的鉴定

3．4 ΔompW与其亲本株生长性能相似

3．6 ΔompW自身凝集能力下降

3．7 ΔompW对四环素类药物敏感性显著升高

4 讨论与结论

4．2 OmpW在鸭源鸡杆菌抵抗四环素中发挥重要作用

第二部分 RZ与ΔompW的抗应激研究

1 引言

2 材料与方法

2．1 菌株

2．2 培养基及主要试剂

2．3 主要仪器

2．4 方法

3 结果与分析

3．2 高渗透压下G．anatis OmpW表达上调

3．3 鸭源鸡杆菌OmpW mRNA相对转录水平分析

3．4 ompW缺失降低了应激抵抗力

4 讨论与结论

4．1 OmpW是鸭源鸡杆菌调节NaCl所必需的

4．2 OmpW与鸭源鸡杆菌耐氧化及热应激有一定相关性

第三部分 RZ与ΔompW的血清杀菌机制的初步探究

1 引言

2 材料与方法

2．1 菌株

2．2 主要试剂和培养基

2．3 主要仪器

2．4 方法

3 结果与分析

3．1 OmpW缺失使血清杀菌能力下降

3．2 抵抗血清杀菌时OmpW表达上调

3．3 抵抗血清杀菌时OmpW mRNA转录上调

3．4 鸭源鸡杆菌通过旁路通路激活补体系统

4 讨论与结论

4．1 OmpW在鸭源鸡杆菌血清杀菌中发挥重要作用

4．2 OmpW抑制补体旁路通路发挥耐血清杀菌活性

第四部分 RZ与ΔompW致病力的研究

1 引言

2 材料与方法

2．1 菌株和试验动物

2．2 主要试剂

2．3 细菌培养

2．4 小鼠半数致死量(LD50)的测定

2．5 对小鼠致病力分析

2．6 鸭源鸡杆菌对鸡原代输卵管上皮细胞黏附性定

2．7 生物被膜形成测定

3 结果与分析

3．2 RZ与ΔompW对小鼠的致病性无显著差异

3．3 RZ和ΔompW对鸡原代输卵管上皮细胞黏附能力相似

3．4 RZ和ΔompW生物被膜形成能力相似

4 讨论与结论

4．1 OmpW缺失后不影响鸭源鸡杆菌对小鼠的致病力

4．2 OmpW参与鸭源鸡杆菌对鸡原代输卵管上皮细胞的黏附

4．3 OmpW对鸭源鸡杆菌生物被膜形成影响很小

第五部分 鸭源鸡杆菌flfA缺失菌株的构建及其生物学特性研究

1 引言

2 材料与方法

2．1 菌株与质粒

2．2 培养基及主要试剂

2．3 主要仪器

2．5 方法

3 结果与分析

3．2 成功构建出质粒pUC18-flfA-U-C-D

3．4 RZ和ΔflfA生长性能及菌落形态相似

3．5 ΔflfA对鸡原代输卵管上皮细胞黏附能力下降

4 讨论与结论

4．1 成功构建了鸭源鸡杆菌flfA缺失突变菌株

4．2 菌毛在鸭源鸡杆菌黏附鸡原代输卵管上皮细胞中发挥主导作用

全文结论

本研究创新点

参考文献

附录