鸭源鸡杆菌中国株gtxA单基因、gtxA/flfA双基因缺失株的构建及相关特性分析

摘要

鸭源鸡杆菌(Gallibacterium anatis，G.anatis)是属于巴氏杆菌科鸡杆菌属的一种革兰氏阴性菌，它定殖在鸡上呼吸和下生殖道正常菌群的一部分。据研究报道，其与鸡的菌血症、嗜卵细胞炎、卵泡变形、输卵管炎、腹膜炎以及呼吸道疾病有关，是引起蛋鸡产蛋量和质量下降、死亡率上升的一种条件性致病菌。因鸭源鸡杆菌与多种疾病病理关系复杂性的存在导致其致病机理的研究仍处于初步阶段。至今，只有几个预测的毒力凶子获得证实，包括RTX样毒素GtxA、菌毛、金属蛋白酶和黏附素等。
　　巴氏杆菌科的大部分菌株都具有溶血活性和白细胞毒性，该特性与能够分泌表达RTX毒素相关，因此RTX毒素蛋白GtxA是鸭源鸡杆菌发挥致病作用的重要致病因子。菌毛在病原菌黏附和入侵靶细胞的过程中扮演着重要的角色。已有研究报道，F-17样菌毛能够与宿主细胞表面含有靶细胞信息的受体结合，参与病原菌识别和定殖于靶细胞的过程。为了了解RTX样毒素及菌毛在鸭源鸡杆菌生物学特性中的功能，进一步研究该菌的致病机理，本研究进行了以下几个方面的研究。
　　1.鸭源鸡杆菌gtxA基因缺失株的构建及其相关特性分析
　　为了了解毒素蛋白GtxA对鸭源鸡杆菌(Gallibacterium anatis，G.anatis)生物学特性及致病性的影响，本研究首先通过M-IV诱导培养基将鸭源鸡杆菌制备成感受态，通过自然转化及同源重组成功构建了G.anatis gtxA突变缺失株ΔgtxA，在此基础上初步探究缺失株的部分生物学特性。并通过亲本株和缺失株△gtxA感染鸡原代输卵管上皮细胞及对小鼠的致病力的差异等初步探索了其致病力的差异。与亲本菌株生物学特性比较，缺失株溶血活性消失，菌落形态及生长速率并未出现显著改变。相对鸭源鸡杆菌RZ株，ΔgtxA对鸡原代输卵管上皮细胞的毒性减弱;在诱导宿主发生免疫反应IL-6、IL-2、TNF-a、IFN-γ炎性因子合成分泌量减少;并且能够在一定程度上减缓细胞凋亡的进程;在小鼠试验巾其致病性也有明显的降低。由于鸭源鸡杆菌具有多种致病因子，仅仅缺失gtxA基冈，并不能完全使其致病性消失。因此，该菌在体内外引起损伤的真正相关性还需要进一步的探究。
　　2.鸭源鸡杆菌gtxA/flfA双基因缺失株的构建及其相关功能特性分析
　　在缺失株ΔgtxA的基础上，利用上述自然转化及同源重组技术，将卡那霉素抗性筛选基因与上下游同源臂构成的靶基因片段转化到鸭源鸡杆菌感受态细胞，经过PCR和Westem Blotting鉴定阳性菌株，成功构建了鸭源鸡杆菌gtxA/flfA基因双缺失株;随后分析了鸭源鸡杆菌RZ、ΔgtxA和ΔgtxA/ΔflfA的生长特性、对鸡原代输卵管上皮细胞黏附性能以及对鸡原代输卵管上皮细胞毒性检测。结果显示缺失株ΔgtxA/ΔflfA生长性能和菌落形态均未出现明显的变化;虽然RZ和ΔgtxA/ΔflfA对鸡原代输卵管上皮细胞的黏附数量随孵育时间的增加而增多，但是FlfA的缺失使ΔgtxA/ΔflfA的黏附数量与RZ的黏附数量相比明显降低(p＜0.05)。证明F-17样菌毛蛋白在鸭源鸡杆菌黏附及毒害鸡原代输卵管上皮细胞中扮演重要角色。鸭源鸡杆菌gtxA/flfA基因双缺失株的构建为进一步探究菌毛的功能奠定了坚实的基础。

目录

声明

论文说明

致谢

英文缩写词表

致谢

摘要

文献综述

1．1 鸡杆菌分类地位的确立

1．2 鸭源鸡杆菌的病原特征

1．3 鸡杆菌的地域分布与宿主范围

1．4 鸡杆菌的传播途径

1．5 鸭源鸡杆菌主要毒力因子

1．6 鸭源鸡杆菌的发病机理及引起的相关疾病

1．7 鸭源鸡杆菌感染的临床征象及病变

1．8 鸭源鸡杆菌感染的诊断

1．9 鸭源鸡杆菌预防与控制

2．1 RTX样毒素概述

2．2 RTX样毒素蛋白的转运

2．3 RTX蛋白家族

2．4 RTX蛋白成孔及靶细胞特性

2．5 RTX蛋白家族新成员GtxA

3 基因敲除(Gene knock)技术

3．1 自杀性质粒导入技术

3．2 Red重组系统

3．3 自然转化

4 小结

试验研究

试验一 鸭源鸡杆菌gtxA基因缺失株的构建及相关特性分析

试验Ⅰ 鸭源鸡杆菌gtxA基因缺失株的构建及其生物特性分析

试验Ⅱ 鸭源鸡杆菌RZ株与AgtxA致病力的研究

试验二 鸭源鸡杆菌gtxA／flfA基因双缺失株的构建及其相关特性分析

引言

1．材料与方法

2 结果与分析

3 讨论与结论

全文总结

参考文献

附