小麦叶片环状RNA高通量鉴定及其在干旱胁迫应答中的功能初探

摘要

小麦（Triticum aestivum）在正常的生长过程中，经常受到干旱胁迫的影响。研究表明，非编码RNA直接或者是间接参加了小麦对干旱胁迫的响应。通过高通量测序技术得知，ckcRNA是一种缺失5'末端帽子和3'末端poly(A)尾巴的具闭环结构的非编码RNA。在人类、动物和植物中，circRNA作为miRNA的海绵，以“解除”miRNA对其靶基因的抑制作用。然而，迄今为止没有关于干旱胁迫下小麦叶片中circRNA的相关报告。
　　为了探讨干旱胁迫下，小麦幼苗叶片中参与调控的circRNA的数量及其潜在的功能，本研究首次使用小麦品种矮抗58（Triticum aestivum L.cv.Aikang58）为材料，在充分浇水(CK组)和PEG处理模拟干旱（PEG组）两种情况下，分别提取出小麦叶片的总RNA，进行了全基因组的circRNA测序，并用生物信息学工具对数据进行分析。
　　本研究在干旱胁迫下，筛选和鉴定了小麦叶片中的circRNA，研究了小麦circRNA的差异化表达的模式，推断了circRNA作为miRNA“海绵”的调控功能，并对差异化表达的circRNA进行实时定量PCR验证，预测了circRNA相对应mRNA的功能分类，从而进一步揭示了circRNA在circRNA-miRNA-gene三者的调节作用。主要试验如下:
　　使用PEG模拟干旱对小麦叶片连续处理5d，小麦幼苗逐渐倒伏，叶片中RWC含量持续降低，而丙二醛(MDA)和H2O2的含量均持续增加。小麦为了减缓干旱对自身造成的损伤，小麦幼苗中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)的含量均所有提高。
　　本研究在小麦幼苗叶片中进行了基于circRNA富集文库的深度测序，鉴定出88种待选circRNA，与对照组相比，其中62种在干旱胁迫中表达差异显著。
　　在干旱应答表达的circRNA中，预测其中的6种对相应的miRNA起到“海绵”作用，并且对这6种circRNA进行了qRT-PCR验证，有5种的结果与转录组测序结果中的表达差异性保持一致。同时，使用GO分析和KEGG分析，分别对miRNA的靶标mRNA的功能进行生物信息学分析之后，预测出circRNA参与干旱应答的过程，例如光合作用、卟啉和叶绿素代谢、氧化磷酸化、氨基酸生物合成和代谢，以及包括生长素、油菜素类固醇和水杨酸在内的植物激素信号转导通路。同时本研究预测了circRNA调控和小麦叶片中与干旱抗性相关的功能基因表达之间可能的联系。

目录

声明

致谢

摘要

1 文献综述

1．1 植物干旱胁迫生理及分子机制

1．1．1 干旱对小麦正常生长的危害

1．1．2 干旱对小麦光合作用的影响

1．2 高通量测序技术在植物抗逆机制研究中的应用

1．2．1 高通量测序技术的发展

1．2．2 RNA-seq在植物抗逆机制研究中的应用

1．3 非编码RNA

1．3．1 小RNA和在植物抗逆中的原理

1．3．2 长非编码RNA的定义和功能

1．3．3 长非编码RNA在植物中特别是抗逆·性研究中应用

1．4 circRNA

1．4．1 circRNA的定义

1．4．2 circRNA的功能

1．4．3 circRNA的发展过程

1．4．4 基于RNA-seq的circRNA不同算法的比较

1．4．5 植物circRNA在抗逆胁迫中的可能作用

1．4．6 本研究的技术路线

2 引言

3 材料与方法

3．1 试验设计

3．2 试验仪器与试剂

3．2．1 主要试验仪器

3．2．2 主要试剂

3．2．3 主要数据库和分析工具

3．2．4 实时定量PCR引物

3．3 试验方法

3．3．1 相对水含量的测定

3．3．2 超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定

3．3．3 过氧化氢酶(CAT)活性的测定

3．3．4 过氧化物酶(POD)活性的测定

3．3．7 总RNA提取和质控

3．3．8 circRNA建库和测序

3．3．9 circRNA的鉴定

3．3．10 预测circRNA的miRNA靶标、miRNA的mRNA靶标和功能注释

3．3．11 验证差异化表达的circRNA

4 结果与讨论

4．1 生理指标

4．1．1 干旱对小麦幼苗叶片生长的影响

4．1．2 干旱对小麦幼苗叶片中相对水含量的影响

4．1．3 干旱对小麦幼苗叶片中MDA和H2O2的影响

4．1．4 干旱对小麦幼苗叶片中抗氢化酶活性的影响

4．2．1 小麦幼苗叶片总RNA质控结果

4．2．2 小麦幼苗叶片circRNA的筛选和鉴定

4．2．3 干旱条件下小麦幼苗叶片circRNA的差异化表达模式

4．2．4 小麦幼苗叶片circRNA作为miRNA“海绵”的调控功能推断

4．2．5 小麦幼苗叶片中差异化表达circRNA的验证

4．3 预测mRNA的功能分类

5 讨论

5．1 干旱对小麦正常生长的危害

5．2 干旱下小麦幼苗叶片circRNA与其他高等植物circRNA的对比

5．3 干旱下小麦幼苗叶片circRNA对其miRNA的海绵作用

5．4 干旱下小麦幼苗叶片circRNA对光合作用网络和激素调控网络的应答

参考文献

附表