PEDV Nsp7对Ⅰ型IFN应答的影响及基于Nsp7间接ELISA抗体检测方法的建立

摘要

猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)主要导致哺乳仔猪的严重呕吐、腹泻、脱水和死亡，也可引起怀孕母猪的腹泻、无乳和生殖周期异常，多个地区连续出现的多个突变株加剧了PEDV的流行，给许多国家的养猪业带来巨大的经济损失。PEDV感染能够强烈抑制宿主Ⅰ型干扰素应答，但是其调控机制尚不完全明了。发掘新的调控宿主抗病毒应答的病毒蛋白，将有助于揭示PEDV如何逃逸机体抗病毒应答。并且，鉴于PEDV毒株类型较多，且该病毒主要危害2周龄以内仔猪，呈现发病急、病程短的特点，所以发展一种能广泛用于PEDV不同毒株的检测以及能用于PEDV的早期诊断的方法将为制定防控PED措施提供指导。
　　冠状病毒的非结构基因在病毒的复制和致病过程中发挥重要作用。本研究首次鉴定了PEDV的非结构蛋白7(nonstructural protein7，Nsp7)，分析了它的序列特征、对其进行了原核表达及免疫原性研究，并确定了其真核表达、亚细胞定位以及对Ⅰ型干扰素应答的影响，另外，本论文利用纯化的原核Nsp7作为俭测抗原，建立了一种可用于PEDV不同毒株的检测和病毒早期诊断的ELISA方法。本论文分为以下三个研究内容:
　　1.猪流行性腹泻病毒Nsp7生物信息学分析、原核表达与多克隆抗体制备
　　为了解PEDV Nsp7的结构特征和免疫原性，本研究通过生物信息学分析Nsp7序列特征、理化性质和空间结构，在此基础上对Nsp7进行原核表达和纯化并制备抗Nsp7多克隆抗体。生物信息学分析结果显示，Nsp7基囚大小为249bp，在不同PEDV毒株间高度保守;Nsp7为稳定蛋白，以单体形式存在，三级结构主要由4个α螺旋片组成。SDS-PAGE试验表明，Nsp7在大肠杆菌中获得大量表达，经纯化后得到单一条带。采用纯化的Nsp7免疫兔子制备多克隆抗体，经ELISA法检测抗体效价为1∶32000，进一步的Western blot和间接免疫荧光试验结果显示，多克隆抗体能够特异性识别重组Nsp7蛋白和PEDV感染细胞的Nsp7蛋白，为后续研究Nsp7的亚细胞定位和功能以及以Nsp7为检测靶标的ELISA方法的建立奠定基础。
　　2.Nsp7的真核表达、亚细胞定位和对Ⅰ型IFN应答的影响
　　为研究PEDV Nsp7的真核表达、亚细胞定位和对细胞Ⅰ型干扰素(IFN)应答的影响，本试验克隆Nsp7基因并构建真核表达载体pCAGGS-Nsp7;分别采用Western blot和间接免疫荧光试验检测Nsp7在细胞中的表达和分布，并进一步通过报告基因法、ELISA、实时定量PCR以及病毒复制抑制试验评估Nsp7对Ⅰ型IFN应答的影响。Western blot结果显示，Nsp7能够在转染细胞中高效表达;间接免疫荧光试验显示Nsp7主要定位在细胞质，仅少量分布在细胞核;双荧光报告基因试验表明Nsp7能显著抑制IFN-β启动子活性，ELISA结果显示Nsp7能显著抑制IFN-β蛋白水平的表达，实时定量PCR结果显示Nsp7能显著下调一些ISGs（ISG15、ISG20和ISG56）基因的转录水平，同时水疱性口炎病毒复制抑制试验显示Nsp7明显抑制poly(I∶C)介导的Ⅰ型IFN的抗病毒作用。结果提示，Nsp7作为PEDV的保守蛋白，具有拮抗Ⅰ型IFN应答的功能.为探讨和揭示PEDV逃逸宿主天然免疫应答的机制及指导临床疫苗使用奠定基础。
　　3.PEDV Nsp7蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立与应用
　　鉴于PEDV毒株类型较多，且PEDV主要危害2周龄以内仔猪，发病急、病程短，因此该病的广泛诊断和早期诊断对于该疾病的预防与控制具有十分重要的意义。试验一的研究结果显示PEDV Nsp7免疫原性良好，且Nsp7基因在PEDV不同毒株间高度保守，鉴于此，本试验以纯化的Nsp7蛋白作为包被抗原，对各种检测条件进行了优化，建立一种可以广泛检测抗PEDV不同毒株抗体的间接ELISA方法。所建立的ELISA方法的最佳反应条件为:抗原包被量为0.2μg/孔，包被条件为37℃1h之后4℃过夜;血清稀释度为1∶300，作用时间为2h;酶标二抗最适稀释度为1∶10000，作用时间为1.5h;TMB显色液作用时间为15min。在优化条件下，临界值的判定标准为:样品S/P值≥0.1694判为阳性，S/P值＜0.1398判为阴性。所建立的ELISA方法特异性、重复性及敏感性均良好。用所建立的ELISA方法对40份来自于疑似猪PEDV血清样品进行检测，该方法与商品化试剂盒检测之间的符合率为95％。本研究建立的ELISA方法在临床上可用于PEDV不同毒株抗体水平的检测，也有用于PEDV早期诊断的潜质，从而为制定有效防控PEDV的措施提供一定依据。

目录

声明

致谢

英文缩写词表

摘要

文献综述

1 PEDV病原学研究进展

1．1 PEDV病原学特性

1．2 PEDV体外培养特性

2 PEDV的基因组特点和冠状病毒非结构基因的功能

2．1 PEDV基因组结构特点

2．2 冠状病毒非结构蛋白及功能

3 冠状病毒与Ⅰ型IFN抗病毒应答

4 PEDV与Ⅰ型IFN抗病毒应答

5 PEDV的诊断方法

6 PED疫苗研究进展

6．1 灭活疫苗

6．2 弱毒疫苗

6．3 新型疫苗

7 本研究的目的和意义

试验一 猪流行性腹泻病毒Nsp7生物信息学分析、原核表达与多克隆抗体制备

1 材料与方法

2 结果

3 小结

试验二 Nsp7的真核表达、亚细胞定位和对Ⅰ型IFN应答的影响

1 材料与方法

2 结果

3 小结

试验三 基于PEDV Nsp7间接ELISA抗体检测方法的建立与应用

1 材料与方法

2 结果

3 小结

全文总结

参考文献

附