α-1,3-甘露糖基转移酶基因FpALG3对假禾谷镰刀菌生长和致病性的影响

摘要

小麦茎基腐病是一种由多种病原菌引起世界性的土传病害，主要病原菌有假禾谷镰刀菌、禾谷镰刀菌及黄色镰刀菌等，在澳大利亚、美国等地假禾谷镰刀菌是引起小麦茎基腐病的主要病原。中国黄淮麦区近年小麦茎基腐病的发生日益严重，研究发现假禾谷镰刀菌是引起该病害的主要病原之一。目前对假禾谷镰刀菌的研究大多停留在形态、分类及遗传多样性等层面，对其致病的分子机理研究还比较匮乏。甘露糖转移酶是参与蛋白N-糖基化的重要酶，以往的研究显示，蛋白糖基化对病原真菌的菌丝生长、繁殖和发育过程具有关键的调控作用，这些糖基化的关键基因在病原真菌的致病过程中起着必不可少的作用。本论文探索从蛋白的N-糖基化方面揭示假禾谷镰刀菌侵染过程的分子机制。
　　根据假禾谷镰刀菌侵染小麦的转录组数据分析结果，发现关于甘露糖转移酶修饰分泌蛋白N端甘露糖基化途径的一个同源基因FpALG3差异表达，通过其中的数据得到FpALG3基因含有1409个核苷酸，有2个内含子，编码432个氨基酸。所以选择了α-1，3-甘露糖转移酶基因作为本研究的重点。采用反向遗传学的研究思路，通过基因敲除技术获得了抗潮霉素的转化子。用四对引物对得到的转化子进行PCR检测筛选，然后再进行Southern验证进一步确认转化子，从而得到真正Δfpalg3敲除突变体。之后，又通过原生质体转化将FpALG3基因重新同源重组回补到敲除突变体内，得到其回补转化子，通过对其表型、致性力以及PCR验证确定其为真的回补突变体。
　　Δfpalg3敲除突变体相较于野生型在生长性状方面表现出明显差异:生长缓慢，菌落生长不规则，色素沉淀呈淡黄色，分生孢子产量下降90％以上，菌落边缘易造成更多分叉。同时，大麦叶片、小麦胚芽鞘和盆栽接种的致病性实验表明该突变体致病性极显著地下降，这表明该基因与假禾谷镰刀菌的致病性相关。利用2kb自身启动子的基因与GFP融合片段成功互补了Δfpalg3缺失突变体的缺陷表型。综合上述研究结果，作者认为α-1，3-甘露糖转移酶基因FpALG3参与假禾谷镰刀菌的生长以及分生孢子的产生，并与致病性相关。

目录

声明

致谢

摘要

1 文献综述

1．1 小麦茎基腐病及假禾谷镰刀菌

1．1．1 小麦茎基腐病及其病原菌

1．1．2 发生危害

1．1．3 防治方法

1．1．4 假禾谷镰刀菌致病的分子机制研究

1．2 蛋白糖基化修饰的研究进展

1．2．1 蛋白糖基化的研究意义

1．2．2 蛋白糖基化类型

1．2．3 蛋白N-糖基化修饰在酿酒酵母(Scerevisiae cerevisiae)中的研究进展

1．2．4 蛋白N-糖基化修饰在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中的研究进展

1．2．5 蛋白N-糖基化修饰在植物病原真菌中的研究进展

1．3 基因功能的研究方法

1．3．1 生物信息学分析

1．3．2 基因功能验证

1．3．3 转录组分析

1．4 本研究的目的和意义

2 引言

3 材料与方法

3．1 实验材料

3．1．1 供试菌株

3．1．2 供试植物

3．1．3 供试载体

3．1．4 供试引物

3．1．5 实验中用到的培养基配方

3．1．6 实验中用到的试剂配方

3．1．7 实验中用到的仪器

3．1．8 实验中用到的生物学分析工具

3．2 实验方法

3．2．1 假禾谷镰刀菌的保存和活化

3．2．2 用CTAB法提取假禾谷镰刀菌的基因组DNA

3．2．3 DNA浓缩

3．2．4 目的基因序列的获取

3．2．5 DNA琼脂糖凝胶电泳

3．2．6 PCR产物纯化

3．2．7 胶回收

3．2．8 TA克隆

3．2．9 质粒的提取

3．2．10 假禾谷镰刀菌FpALG3基因同源重组序列的构建

3．2．11 PEG介导的假禾谷镰刀菌的原生质体转化

3．2．12 FpALG3基因的敲除转化子验证

3．2．13 假禾谷镰刀菌FpALG3基因回补载体的构建以及回补转化子的验证

3．2．14 FpALG3基因突变体生长性状测定

3．2．15 FpALG3基因突变体致病性检测

4 结果与分析

4．1 FpALG3基因的同源性分析

4．1．1 FpALG3基因序列及其编码的氨基酸序列的获取

4．1．2 FpALG3基因编码的氨基酸序列同源性比对分析

4．1．3 FpALG3基因转录组数据分析

4．2 FpALG3基因的同源重组序列的构建和验证

4．3 FpALG3基因敲除转化子的验证

4．3．1 PCR验证

4．3．2 Southern blot验证

4．4 FpALG3基因回补转化子的PCR检测

4．4．1 FpALG3基因回补载体的构建

4．4．2 FpALG3基因回补转化子的验证和PCR检测

4．4．3 cfpalg3回补突变体的荧光检测

4．5 Δfpalg3敲除突变体的生长性状和致病力检测

4．5．3 Δfpalg3敲除突变体的菌丝能够形成更多分叉

4．5．5 Δfpalg3敲除突变体接种小麦胚芽鞘的致病性基本丧失

4．5．6 Δfpalg3敲除突变体接种小麦茎基部的致病性明显下降

5 结论与讨论

5．1 结论

5．2 讨论

参考文献