编码α 1，6－甘露糖基转移酶的新的多形汉逊氏酵母基因和用同一基因有缺陷的多形汉逊氏酵母突变株生产重组糖蛋白的方法

摘要

本发明公开了编码在N－联糖基化起始外链延伸的α－1，6－甘露糖基转移酶的多形汉逊氏酵母的新基因、该基因有缺陷的多形汉逊氏酵母突变株、和使用这种突变株生产重组糖蛋白的方法。

说明书

技术领域

本发明涉及编码起始外链延伸的α-1，6-甘露糖基转移酶的多形汉逊氏酵母(Hansenula polymorpha)新基因、该基因有缺陷的多形汉逊氏酵母突变株、和使用这种突变株生产重组糖蛋白的方法。

背景技术

在大规模表达治疗性蛋白时，根据宿主细胞或靶蛋白的特征，靶蛋白在表达水平、水溶性、表达部位、修饰等方面可能有差异。因此，必须选择靶蛋白的最适表达系统，以建立有效生产系统。

大多数治疗性蛋白是在通过内质网(ER)和高尔基体时，其中寡糖与天冬酰胺残基共价连接的糖蛋白(Jenkins et al.，Nat.Biotechnol.，14，975-9，1996)。糖部分的结构和类型大大影响糖蛋白的折叠、生物活性和在血清中的稳定性。因此，迄今为止，对于生产具有野生型糖部分和治疗活性的治疗性重组糖蛋白来说，最常使用的方法是使用动物细胞表达系统。然而，动物细胞培养系统有缺点，包括产量低、由于培养基昂贵造成的成本高、逆转录病毒污染和建立稳定细胞系所需时间长。因此，动物细胞培养系统在生产重组糖蛋白中应用有限。在这方面，已进行了许多尝试，使用酵母表达系.统作为动物细胞表达系统的替代选择来生产医学重要的重组糖蛋白，该系统是真核生物并共享高等动物细胞N-联糖基化途径的早期步骤。

真核生物如酵母具有高产量蛋白生产迅速、利用灭菌和生产条件很好控制、易于基因工程改造、没有被人或动物病原体感染的风险、和确保蛋白回收容易的优点。然而，在酵母中合成的完全型具有与靶生物如哺乳动物不同的糖部分，并因此可能在动物细胞中引起免疫反应。而且，这种高甘露糖型的酵母特异性外链糖基化，也表示为超糖基化，引起重组蛋白质产物的异质性，可能使蛋白纯化复杂或困难。此外，由于碳水化合物水平增加，酶的比活性可能降低(Bekkers et al.，Biochem.Biophy.Acta.1089，345-351，1991)。

为解决上述问题，需要将能产生糖蛋白的动物细胞糖基化途径导入酵母的糖工程(glycotechnology)，所述糖蛋白具有与来源于哺乳动物的糖蛋白相同的生物活性。

当重组糖蛋白在传统酵母—酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中表达时，一系列50至200个甘露糖残基添加至核心寡糖导致高甘露糖化(hypermannosylation)，以及在体内被视为抗原的α-1，3联末端(linked terminal)甘露糖的存在被视为使用酵母作为宿主生产糖蛋白的巨大限制(Dean，Biochim.Biophys.Acta.，1426，309-322，1999；Ballou，Methods Enzymol.，185，440-444，(1990))。相比之下，当重组糖蛋白在甲基营养酵母—多形汉逊氏酵母和巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)中表达时，与天然形式相比，它们以高甘露糖化形式表达，但是甘露糖外链全长比酿酒酵母中表达的稍短(Kang et al.，Yeast 14，371-381，1998；Kim et al.，Glycobioloby，in press，2004；Bretthauer and Castellino，Biotechnol.Appl.Biochem.30，193-200，1999)。特别是，由于甲基营养酵母-多形汉逊氏酵母和巴斯德毕赤氏酵母中合成的糖链不含强免疫原性的α-1，3-联末端甘露糖(Kim et al.，Glycobioloby，in press，2004；Montesino et al.，Protein Expr.Purif.14，197-207，1998)，因此对于对人类具有治疗价值的糖蛋白的生产，认为甲基营养酵母是优于传统酵母-酿酒酵母的宿主系统。

在糖工程领域中进行了很多尝试，使用巴斯德毕赤氏酵母和酿酒酵母开发能够生产含人相容糖链的治疗性重组糖蛋白的宿主(Chiba et al.，J.Biol.Chem.，273，26298-26304，1998；Callewaert et al.，FEBS Lett.，503，173-178，2001；Choi etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，100，5022-5027，2003；Hamilton et al.，Science，301，1244-1246，2003)。例如，尝试了使用重组酿酒酵母生产糖蛋白，该糖蛋白中结合了包括人甘露糖型Man₅GlcNAc₂N-聚糖的中间体，该酵母是通过进一步基因操作三联酵母突变株(och1Δmnn1Δmnn4Δ)以在ER中表达哺乳动物α-1，2-甘露糖苷酶而获得的(Chiba et al.，J.Biol.Chem.，273，26298-26304，1998)。三联突变株剔除了三个基因：在外链起始中起决定性作用的OCH1(Nakanishi-Shindo et al.，J.Biol.Chem.268，26338-26345，1993；美国专利5,705,616；美国专利5,798,226)；介导添加免疫原性的α-1，3-联末端甘露糖的MNN1(Gopal and Ballou，Proc.Natl.Acad.Sci.USA84，8824，(1987)；美国专利5,135,854)；和将磷酸酯添加至糖链的MNN4(Jigami andOdani，Biochim.Biophys.Acta.，1426，335-345，1999)。此外，根据最近的研究，(Choi et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，100，5022-5027，2003；Hamilton etal.，Science，301，1244-1246，2003)，为了将人糖基化途径导入已剔除介导外链起始的OCH1基因的突变株中(日本专利07145005；日本专利07150780；国际专利出版物WO 0200856 A2；国际专利出版物WO 0200879 A2)，在巴斯德毕赤氏酵母中进行宿主开发，通过将来源于真核生物的五种不同的酶导入分泌途径，以生产具有人复合型N-聚糖GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂的重组糖蛋白。然而，迄今为止，从糖工程的观点来看，很少尝试在甲基营养酵母-多形汉逊氏酵母中生产具有人型糖链的重组糖蛋白，该酵母作为表达治疗性重组蛋白的宿主得到普及，因为它已经用于生产肝炎疫苗。

如韩国专利申请号2002-37717中所述，本发明人在本发明前克隆了在多形汉逊氏酵母外链合成中起决定性作用的OCH1基因，建立了剔除OCH1基因的突变株(Hpoch1Δ)，并开发了利用这样一个突变株通过阻止高糖基化制备具有与天然形式接近的糖链结构的重组糖蛋白的方法。然而，在该已剔除OCH1基因的多形汉逊氏酵母的Hpoch1Δ突变株中，α-1，6-甘露糖键仍然起始外链糖基化。因此，需要寻找编码α-1，6-甘露糖基转移酶的基因和阻止上述人不相容糖基化途径。

发明内容

为了克服上述问题和使用甲基营养耐热酵母—广泛用作各种异源基因大量表达的宿主系统的多形汉逊氏酵母开发对人类具有治疗价值的重组糖蛋白的生产系统，本发明人基于已知的多形汉逊氏酵母基因组信息，克隆了多形汉逊氏酵母菌株DL-1中的新基因HpOCH2，确定了该新基因具有负责外链起始的α-1，6-甘露糖基转移酶活性，和开发了已剔除上述基因的突变株。然后，本发明人发现该突变株能阻止人不相容糖基化途径，和当异源糖链修饰的酶在突变株中表达时，能够产生具有人甘露糖型N-聚糖Man₅GlcNAc₂而不是酵母特异的N-聚糖的重组糖蛋白，因而引出了本发明。

附图简述

由下列详细说明书结合附图将更清楚地理解本发明的上述和其它目的、特征和其它优点，其中：

图1显示了多形汉逊氏酵母HpOCH2基因的核苷酸序列及其预测的氨基酸序列，其中带下划线的是跨膜区(transmembrane spanning region)，用粗体并带下划线的是相当于DXD元件的氨基酸序列；

图2是多形汉逊氏酵母和其它酵母菌株的Och1蛋白类似物氨基酸序列的多重比对(HpOch2p：多形汉逊氏酵母Och2蛋白；HpOch1p：多形汉逊氏酵母Och1蛋白；CaOch1p：白色念珠菌(Candida albicans)Och1蛋白；PpOch1p：巴斯德毕赤氏酵母Och1蛋白；ScOch1p：酿酒酵母Och1蛋白；和SpOch1p：粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)Och1蛋白)，其中插入的数字表示多形汉逊氏酵母HpOch2p和其它酵母菌株的Och1p类似物之间的氨基酸同一性；

图3是通过体内DNA重组诱导多形汉逊氏酵母HpoCH2基因剔除的图；

图4显示了多形汉逊氏酵母Hpoch2Δ突变株的生长特性，其中到达指数期的多形汉逊氏酵母野生型和两个突变株Hpoch1Δand Hpoch2Δ的培养物(OD₆₀₀＝1)被连续稀释10倍，和3μl每种稀释物点滴在YPD培养基上并培养两天(A：YPD培养基，在37℃；B：YPD培养基，在45℃；C：补充40μg/ml潮霉素B的YPD培养基；D：补充0.4％脱氧胆酸钠的YPD培养基；和E：补充7μg/ml荧光增白剂(Calcofluor white)的YPD培养基)；

图5显示了与多形汉逊氏酵母Hpoch2Δ突变株中表达的葡萄糖氧化酶(GOD)结合的糖链大小分布和结构的HPLC分析结果，其中左组(A、B和C)和右组(D、E和F)代表分别在多形汉逊氏酵母野生型和Hpoch2Δ突变体中表达的GOD结合的糖链的结果(A和D：与GOD结合的糖链谱；B和E：α-1，2-甘露糖苷酶处理后的糖链谱；和C和F：α-1，6-甘露糖苷酶随后处理后的糖链谱)，和用箭头指出已知大小和结构的标准寡糖的保留时间(M5：Man₅GlcNAc₂-PA；M6：Man₆GlcNAc₂-PA；M8：Man₈GlcNAc₂-PA；和M11：Man₁₁GlcNAc₂-PA)；

图6显示了通过导入HpOCH2基因，酿酒酵母och1Δ突变体功能代偿的试验结果(1：对照载体YEp352GAPII转化的野生型酿酒酵母；2：对照载体转化的酿酒酵母och1Δ突变株(Scoch1Δ)；和3、4和5：分别用HpOCH1基因表达载体YEp352GAPII-HpOCH1(3)、HpOCH2基因表达载体YEp352GAPII-HpOCH2(4)和ScOCH1基因表达载体YEp352GAPII-ScOCH1(5)转化的Soch1Δ突变株，其中到达指数期的酵母培养物(OD₆₀₀＝1)被连续稀释10倍，和3μl每种稀释物点滴在YPD板上并在25℃和30℃培养三天(图6的A)和通过活性染色检测每个转化体中表达的转化酶的糖基化(图6的B)；

图7显示了测定HpOch2蛋白的α-1，6-甘露糖基转移酶活性的试验结果，其中酿酒酵母och1Δmnn1Δmnn4Δ突变株被对照载体YEp352GAPII(A)、HpOCH2基因表达载体YEp352GAPII-HpOCH2(B)或ScOCH1基因表达载体YEp352GAPII-ScOCH1(C)转化，和从突变株获得的膜部分与Man₈GlcNAc₂-PA在30℃反应两小时，接着用HPLC分析；

图8显示了与多形汉逊氏酵母菌株中表达的GOD结合的糖链大小分布和结构的HPLC分析结果(A和D：分别在多形汉逊氏酵母野生型和Hpoch2Δ突变株中以分泌形式表达的GOD的糖链谱；B和E：分别在多形汉逊氏酵母野生型和Hpoch2Δ突变株中表达的GOD的糖链谱，其中Hpoch2Δ突变株被基因改造以表达来自斋藤曲霉(Aspergillussaitoi)的α-1，2-甘露糖苷酶；和C和F：用α-1，2-甘露糖苷酶处理分别来自重组野生型和突变株的糖链后的糖链谱)；和

图9显示了酿酒酵母和多形汉逊氏酵母的Och1蛋白同源物之间的氨基酸序列同一性和相似性。

发明最佳实施方式

在真核生物中，蛋白N-糖基化发生于内质网(ER)，在那里，N-联寡糖(Glc₃Man₉GlcNAc₂，)转移至新生蛋白的合适天冬酰胺残基。从Glc₃Man₉GlcNAc₂，三个葡萄糖残基和一个特异的α-1，2-联甘露糖残基被ER中的特异的葡糖苷酶和α-1，2-甘露糖苷酶除去，产生核心寡糖结构-Man₈GlcNAc₂。具有这个核心糖结构的蛋白被转运到高尔基体，在那里糖部分经历各种特异酶的各种修饰。在酵母中，高尔基体中糖链的修饰包括由不同甘露糖基转移酶催化的一系列甘露糖残基的添加。外链糖基化作用的结构对于生物是特异性的，典型地在酿酒酵母中具有50个以上的甘露糖残基。

本发明人基于已知的多形汉逊氏酵母基因组信息，在多形汉逊氏酵母DL-1菌株中克隆了HpOCH2基因，并鉴定了上述基因具有负责外链起始的α-1，6-甘露糖基转移酶活性。被鉴定的基因具有表示为SEQ ID NO.1的核苷酸序列和其相应表示为SEQ ID NO.2的氨基酸序列。

在一个方面，本发明提供了编码表示为SEQ ID NO.2的蛋白的DNA基因。此外，本发明提供了编码与前述DNA具有75％或更高同源性的蛋白质且编码具有α-1，6-甘露糖基转移酶活性的蛋白的DNA基因。优选，本发明提供了具有表示为SEQ ID NO.1的DNA序列的基因、其类似物或其片段。

本发明中用于来源于多形汉逊氏酵母的α-1，6-甘露糖基转移酶基因的术语“同源性”是用来指出与野生型核苷酸序列的相似度，并包括与编码α-1，6-甘露糖基转移酶的DNA序列具有优选75％或更高、更优选85％或更高、和最优选90％或更高同一性的DNA序列。这种同源性比较可以人工或通过使用市场上可买到的比较程序来进行。市场上可买到的计算机程序可以用百分比表示两个或更多序列之间的同源性，和计算邻近序列的同源性(％)。

本发明人在GenBank中登记了上述基因，登录号为AY502025，并保藏了含有该基因的重组载体pBS-HpOCH2/大肠杆菌DH5@，于2004年1月15日保藏在KCTC(韩国典型培养物保藏中心(Korean Collection for Type Cultures)；KRIBB，韩国大田宇松区欧洞52，Oun-dong，Yusong-ku，Taejon，Korea)，保藏号为KCTC 10583BP。

因此，在另一个方面，本发明提供了包含基因的重组载体，该基因是编码表示为SEQ ID NO.2的蛋白的DNA或与前述DNA具有90％或更高同源性且编码具有α-1，6-甘露糖基转移酶活性的蛋白的DNA。重组载体优选包含表示为SEQ ID NO.1的DNA基因。在又一方面，本发明提供了该重组载体转化的宿主细胞，和优选，提供了以保藏号KCTC 10583BP保藏的转化宿主细胞。

为了在酵母中生产具有哺乳动物型糖链的糖蛋白，应当建立一种酵母突变株，该酵母突变株缺乏在酵母外链生物合成中所涉及的酶家族。这种突变株可以通过基因突变，如使用试剂、紫外线照射或自发突变或通过人工剔除目标基因而获得。在本发明中，通过基因工程方法，也就是说通过聚合酶链式反应和体内DNA重组联合剔除编码在外链起始中起决定性作用的α-1，6-甘露糖基转移酶的基因(Och2)。

本发明人确立了一种多形汉逊氏酵母Hpoch2Δ突变株(多形汉逊氏酵母DL-1och2Δ)，其中如上所述鉴定的α-1，6-甘露糖基转移酶基因缺失，并发现在该突变株中，α-1，6-甘露糖残基的酵母特异的连续添加被阻止，因此高糖基化作用显著减少。该突变株于2004年1月15日保藏在KCTC(韩国典型培养物保藏中心；KRIBB，韩国大田宇松区欧洞52)，保藏号为KCTC 10584BP。

因此，在又一个方面，本发明提供了以保藏号KCTC 10584BP保藏的多形汉逊氏酵母Hpoch2Δ突变株(多形汉逊氏酵母DL-1och2Δ)。

从ER转运来的糖蛋白上大多数N-聚糖具有Man₈GlcNAc₂糖链结构。蛋白从ER转运至高尔基体之后，另外的甘露糖残基被不同的甘露糖基转移酶添加至蛋白，产生具有很多甘露糖糖链的糖蛋白。高糖基化作用在重组糖蛋白中是不合需要的。使用本发明制备的多形汉逊氏酵母突变株作为表达重组蛋白的宿主细胞可以减少这种高糖基化作用。此外，当用能够表达具有在糖链修饰中所涉及的酶活性的一个或多个蛋白的表达载体转化多形汉逊氏酵母突变株时，可以更有效抑制高糖基化作用或被转化为具有不同结构的糖链。在减少这种高糖基化作用中所涉及到的糖链修饰酶包括α-1，2-甘露糖苷酶、甘露糖苷酶IA、甘露糖苷酶IB、甘露糖苷酶IC、甘露糖苷酶II、N-乙酰葡萄糖胺转移酶I、N-乙酰葡萄糖胺转移酶II、半乳糖转移酶、唾液酸转移酶和岩藻糖基转移酶。然而，本发明不限于上述实例，并且也可以使用能够导致重组糖蛋白高糖基化减少和修饰的各种基因。在本发明的一个实施方案中，当α-1，2-甘露糖苷酶在多形汉逊氏酵母Hpoch2Δ突变株中表达时，产生了阻止酵母型N-聚糖形成并将其修饰为人型N-聚糖的重组糖蛋白。α-1，2-甘露糖苷酶除去了Man₈GlcNAc₂非还原末端的α-1，2联甘露糖残基并将这个糖蛋白上的核心糖链转变为Man₅GlcNAc₂。Man₅GlcNAc₂结构是位于高尔基体甘露糖基转移酶的次级底物，产生甘露糖含量减少的糖蛋白。转化中使用的表达载体中包含的糖链修饰酶基因可以是编码这种酶的全基因序列或编码该酶功能区的片段序列。该表达载体包括整合型(integrative)或诱导型启动子和3’终止序列，和可以是整合型或复制型载体。

因此，仍在另一个方面，本发明提供了进一步包含表达糖链修饰酶的表达载体的多形汉逊氏酵母突变株。优选，糖链修饰酶选自包括α-1，2-甘露糖苷酶、甘露糖苷酶IA、甘露糖苷酶IB、甘露糖苷酶IC、甘露糖苷酶II、N-乙酰葡萄糖胺转移酶I、N-乙酰葡萄糖胺转移酶II、半乳糖转移酶、唾液酸转移酶和岩藻糖基转移酶。

仍在另一个方面，本发明提供了使用以保藏号KCTC10584BP保藏的多形汉逊氏酵母突变株生产糖基化作用减少的重组糖蛋白的方法。

根据如上所述的方法，可以以阻止酵母型N-聚糖形成和将酵母型N-聚糖修饰为人型N-聚糖的方式生产重组糖蛋白。

在此使用的术语“糖蛋白”是指当在甲基营养酵母，尤其是多形汉逊氏酵母中表达时，在一个或多个天冬酰胺或一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基上被糖基化，或在天冬酰胺和丝氨酸或苏氨酸残基上被糖基化的蛋白。在此使用的术语“糖基化减少”意思是当糖蛋白在甲基营养酵母菌株中表达时，与在野生型甲基营养酵母中表达的情况相比，它的碳水化合物部分大小减少，尤其是甘露糖残基减少。

在上述方法中，导入多形汉逊氏酵母Hpcho2Δ的突变株的糖蛋白表达载体优选表达糖链修饰酶如α-1，2-甘露糖苷酶和糖蛋白。

可以用本领域常用的方法纯化产生的糖蛋白，和可以根据待纯化特定蛋白的性质决定纯化方案。认为这种决定是本领域技术人员的普通技能。例如，可以用典型的分离技术纯化目标蛋白，如沉淀、免疫吸附、分馏或各种层析法。

根据本发明能够生产的糖蛋白可以示例如下：细胞因子(例如干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ、G-CSF等)、凝血因子(例如因子VIII、因子IX、人C蛋白)、内皮生长因子、生长激素释放因子、青霉菌属(Penicillium minioluteum)葡聚糖酶、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)α-淀粉酶、酿酒酵母天冬氨酸蛋白酶、酿酒酵母转化酶、克氏锥虫(Typanosoma cruzi)唾液酸转移酶(trans-sialidase)、HIV包膜蛋白、流感病毒A血细胞凝集素、流感神经氨酸苷酶、牛肠激酶活化剂、牛疱疹病毒1型糖蛋白D、人血管抑制素、人B7-1、B7-2和B-7受体CTLA-4、人组织因子、生长因子(例如血小板衍生生长因子)、人α-抗胰蛋白酶、人红细胞生成素、组织纤溶酶原激活物、纤溶酶原激活物抑制剂-1、尿激酶、α-半乳糖苷酶、纤溶酶原、凝血酶和免疫球蛋白。

仍在另一个方面，本发明提供了用上述方法生产的糖蛋白。

通过下列实施例可以达到对本发明更好的理解，这些实施例为了阐明而陈述，而不应解释为对本发明的限制。

实施例1：多形汉逊氏酵母HpOCH2基因的鉴定和该基因氨基酸序列的分析

从新近完成的多形汉逊氏酵母RB11基因组的测序(Ramezani-Rad et al.，FEMSYeast Res.，4，207-215(2003))中，获得了与OCH1基因家族具有高相似性的ORFs(开放阅读框)全序列，其中OCH1基因家族参与酿酒酵母外链的生物合成。图9显示了多形汉逊氏酵母和酿酒酵母Och1蛋白同源物之间的氨基酸序列同一性和相似性，其中ORF168和ScOch1p之间的氨基酸序列同一性和相似性用阴影粗体数字表示。

在本发明中，为了对ORF168基因进行功能分析，使用从多形汉逊氏酵母DL-1提取的DNA(Levine and Cooney，Appl.Microbiol.，26，982-990，(1973))作为模板和一对引物(168Not-N和168Not-C；表1)进行聚合酶链式反应(PCR)，其中ORF168基因与在酿酒酵母外链生物合成早期α-1，6-甘露糖添加中起决定性作用的酿酒酵母OCH1基因(ScOCH1)(Jungman and Munro，Embo J.17，423(1998))具有40％氨基酸同一性和54％氨基酸相似性。结果，获得了含有ORF168的1.35-kb DNA片段，和然后进行氨基酸测序。

本发明人申请的韩国专利申请2002-37717中描述的常规鉴定的多形汉逊氏酵母基因具有的氨基酸序列与酿酒酵母OCH1基因具有22％同一性和36％相似性因而被命名为HpOCH1。在这点上，本发明中鉴定的ORF168被命名为HpOCH2，并且其核苷酸序列登记在GenBank中，登录号为AY502025。HpOCH2长1287bp并预测编码由428个氨基酸组成的蛋白。HpOch2蛋白从29至51位具有潜在的跨膜区，因而被认为是大多数糖基转移酶所属的II型膜蛋白(图1)。而且，观察到HpOch2蛋白具有已知为糖基转移酶活性部位(Lussier et al.，J.Cell.Biol.，131，913-927，(1995))的DXD元件，因而预测具有糖基转移酶活性(图1)。发现除了酿酒酵母OCH1基因产物之外，HpOch2蛋白的氨基酸序列与其它酵母OCH1基因产物具有相对高的相似性，其它酵母为白色念珠菌：Thomas et al.，结果未发表，GenBank登录号AY064420)、巴斯德毕赤氏酵母：日本专利07145005)、粟酒裂殖酵母：Yoko-o et al.，FEBS Lett.，489，75-80，(2001))(图2)。

实施例2：多形汉逊氏酵母HpOCH2基因缺陷菌株的建立和该菌株特性的分析

为建立多形汉逊氏酵母HpOCH2基因缺陷突变株，通过融合PCR和体内DNA重组(Oldenburg et al.，Nucleic Acid Res.，25，451，(1997))联合剔除基因。使用下面表1所列引物(引物用于克隆和剔除HpOCH2基因的PCR)进行融合PCR。通过初次PCR，获得了URA3基因和HpOCH2基因的5’和3’区。通过第二次融合PCR，HpOCH2基因5’区与URA3基因5’区连接，和URA3基因3’区与HpOCH2基因3’区连接。然后，将这两个DNA片段导入酵母细胞，选择通过体内DNA重组已剔除了HpOCH2基因的转化体(图3)。首先，使用URA3选择标记，选择在缺乏尿嘧啶的基本培养基中生长的转化体。然后，检测PCR扩增的DNA片段以确定它们是否不同于野生型菌株的片段，由此选择具有不同扩增模式的多形汉逊氏酵母突变株Hpoch2Δ(leu2och1∷URA3)。评价获得的Hpoch2Δ菌株的生长特性。发现Hpoch2Δ菌株如同Hpoch1Δ菌株(KCTC 10264BP)具有45℃的温度敏感性，但不同于Hpoch1Δ菌株的是在37℃具有与野生型类似的生长速度。而且，在潮霉素B存在下，大大抑制了生长，并观察到对脱氧胆酸钠的几乎不敏感(图4)。既然生长特性在外链合成具有缺陷的突变株中是共同的，那么认为多形汉逊氏酵母Hpoch2Δ菌株外链糖基化过程具有缺陷。

表1

实施例3：多形汉逊氏酵母Hpoch2Δ突变株中合成的糖蛋白上糖链的大小分布和结构分析

为分析实施例2制备的多形汉逊氏酵母Hpoch2Δ突变株中合成的糖蛋白上糖链的大小分布和结构，在多形汉逊氏酵母野生型和Hpoch2Δ突变株中以分泌形式表达来源于黑曲霉(Aspergillus niger)的糖蛋白葡萄糖氧化酶(GOD)。该糖蛋白GOD具有N-联糖基化的八个推定的氨基酸序列(Frederick et al.，J.Biol.Chem.，265，3793(1990))。用表达具有六个组氨酸标记的GOD的表达载体pDLMOX-GOD(H)逐一转化多形汉逊氏酵母野生型和Hpoch2Δ突变株(Kim et al.，Glycobiology(2004))，并在补充2％甲醇的YPM培养基(1％酵母浸膏、2％蛋白胨、2％甲醇)中生长以表达GOD。分泌到培养基的GOD通过镍柱仅选择分离C末端区被六个组氨酸标记的GOD。用PNGase F处理分离的重组组氨酸-标记的GOD以从GOD中分离结合的糖链。然后，用2-氨基吡啶(2-PA)标记释放的糖链并进行HPLC分析。如图5A和D所示，发现来源于野生型的重组GOD的糖链具有从8至12个甘露糖残基的各种大小分布。相比之下，发现Hpoch2Δ突变株中表达的重组GOD结合的糖链主要具有含8个甘露糖残基的核心糖链。这些结果表明在Hpoch2Δ突变株中，第八个甘露糖残基之后的糖添加被大大抑制。分别地，用α-1，2-甘露糖苷酶和α-1，6-甘露糖苷酶顺序处理从重组GOD释放的糖链以研究糖链谱的改变。野生型合成的糖链转变为相当于五个或六个甘露糖的糖链，和接着它们全部被α-1，6-甘露糖苷酶转变为相当于五个甘露糖的糖链，而Hpoch2Δ突变株的全部糖链仅被α-1，2-甘露糖苷酶转变为相当于五个甘露糖的糖链(图5)。这些结果揭示了由α-1，6-甘露糖键的外链延伸的起始决不发生在Hpoch2Δ突变株中，因此表明HpOCH2基因产物直接或间接参与α-1，6-甘露糖苷酶的活动中。

实施例4：多形汉逊氏酵母HpOCH2蛋白的功能分析

为确定多形汉逊氏酵母HpOCH2基因产物是否是在外链合成起始过程中将α-1，6甘露糖添加至核心糖链的酿酒酵母Och1蛋白的功能性同源物，将携带HpOCH2基因的表达载体YEp352GAPII-HpOCH2导入已剔除了酿酒酵母OCH1基因的突变株Scoch1Δ中，和评价Scoch1Δ突变株克服温度敏感性的能力(图6的A)。HpOCH2、HpOCH1和ScOCH1基因逐一插入导入酿酒酵母表达载体YEp352的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAP)启动子和终止子之间(Hill et al.，Yeast，2，163-167，(1986))，因而分别产生表达载体YEp352GAPII-HpOCH2、YEp352GAPII-HpOCH1和YEp352GAPII-ScOCH1。当HpOCH2基因表达载体(YEp352GAPII-HpOCH2)转化酿酒酵母Scoch1Δ突变株时，该突变株恢复了其在高温下生长的能力。相比之下，当用携带与HpOCH2基因具有核苷酸序列相似性的HpOCH1基因的表达载体(YEp352GAPII-HpOCH1)转化时，Scoch1Δ突变株没有克服温度敏感性(图6的A)。此外，评价Scoch1Δ突变株在高糖基化中具有缺陷的另一个特征。当HpOCH2表达载体导入Scoch1Δ突变株时，如图6中的B所示，糖蛋白转化酶的糖基化恢复至与其中导入OCH1表达载体(YEp352GAPII-ScOCH1)时相同的水平。相比之下，当HpOCH2表达载体导入Scoch1Δ突变株时，转化酶的糖基化没有变化。酿酒酵母och1Δ突变株克服了温度敏感性和通过多形汉逊氏酵母HpOCH2基因的表达恢复高糖基化的结果证明HpOCH2基因产物是酿酒酵母Och1蛋白的功能性类似物，其中酿酒酵母Och1蛋白在外链合成第一步中起决定性作用。

进行体外试验确定多形汉逊氏酵母HpOch2蛋白事实上是否如同酿酒酵母Och1蛋白具有α-1，6-甘露糖基转移酶活性，将α-1，6-甘露糖添加至核心糖链。三个基因OCH1、MNN1和MNN4都被剔除的突变株(och1Δmnn1Δmnn4Δ)完全丧失外链合成能力(Chiba et al.，J.Biol.Chem.，273，26298-26304，(1998))。用多形汉逊氏酵母HpOCH2基因表达载体转化och1Δmnn1Δmnn4Δ突变株，和制备膜部分。膜部分用作测定α-1，6-甘露糖基转移酶的酶源和与具有核心糖链结构的底物Man₈GlcNAc₂-PA反应。用HPLC分析产生的反应溶液。当用不含HpOCH2基因的Yep352GAPII载体转化och1Δmnn1Δmnn4Δ突变株时，膜部分中底物Man₈GlcNAc₂-PA的浓度没有改变。相比之下，当分别用多形汉逊氏酵母HpOCH2基因表达载体和酿酒酵母OCH1基因表达载体转化och1Δmnn1Δmnn4Δ突变株时，在膜部分中观察到相当于Man₉GlcNAc₂-PA(单一甘露糖添加至Man₈GlcNAc₂-PA形成的结构)的峰(图7)。这些结果表明多形汉逊氏酵母HpOch2蛋白如同酿酒酵母Och1蛋白具有参与外链延伸起始的α-1，6-甘露糖基转移酶活性。

实施例5：使用多形汉逊氏酵母Hpoch2Δ突变株的糖工程

能够产生具有人甘露糖型N-联聚糖的重组糖蛋白的多形汉逊氏酵母菌株建立如下。如以前研究中所述用传统酵母—酿酒酵母进行的(Chiba et al.，J.Biol.Chem.，273，26298-26304，(1998))，为了在多形汉逊氏酵母ER中表达斋藤曲霉(Aspergillussaitoi)α-1，2-甘露糖苷酶，用应用于多形汉逊氏酵母的α-1，2-甘露糖苷酶表达载体pDUMOX-MsdS(HA-HDEL)转染多形汉逊氏酵母Hpoch2Δ突变株，由此开发糖工程改造的重组菌株Hpoch2Δ-MsdSp。为构建α-1，2-甘露糖苷酶表达载体pDUMOX-MsdS(HA-HDEL)，使用含有斋藤曲霉(Aspergillus saitoi)α-1，2-甘露糖苷酶的质粒pGAMH1(Chiba et al.，J.Biol.Chem.，273，26298-26304，(1998))作为模板，和含有EcoRI位点的正向引物(5′-GGGGAATTCAAAAAAATGGTGGTCTTCAGCAAA-3′：SEQ ID.NO.13)和含有决定蛋白表达水平的HA序列、HEDL(His-Asp-Glu-Leu)序列作为内质网保留/回收标记和NcoI位点的反向引物(5′-GGGCCATGGTCACAATTCATCATGCGCATAGTCAGGAACATCGTATGGGTATGTACTACTCACCCGCAC-3′：SEQ ID.NO.14)，进行PCR。结果，扩增了斋藤曲霉(A.saitoi)α-1，2-甘露糖苷酶，由此产生1.5-kb片段。用EcoRI和NcoI消化1.55-kb片段并取代GOD表达载体pDLMOX-GOD(H)的GOD基因(Kim et al..Glycobiology，in press，(2003))。然后，在所产生的GOD表达载体中，用多形汉逊氏酵母URA3选择标记取代多形汉逊氏酵母LEU2选择标记，由此最后产生α-1，2-甘露糖苷酶表达载体pDUMOX-MsdS(HA-HDEL)。使用抗HA抗体(Sigma)的Western印迹检测斋藤曲霉(A.saitoi)α-1，2-甘露糖苷酶在多形汉逊氏酵母中的表达。

为确定糖工程改造的多形汉逊氏酵母菌株Hpoch2Δ-MsdSp是否合成人甘露糖型N-聚糖，分析以分泌形式表达的与GOD结合的糖链结构。在由异源α-1，2-甘露糖苷酶转化的HpOCH2-MsdSp重组野生型菌株中，具有8个或更多甘露糖残基的糖链急剧减少，而具有5个或6个甘露糖残基的糖链增加(图8的A和B)。在由异源α-1，2-甘露糖苷酶转化Hpoch2Δ菌株而制备的重组Hpoch2Δ-MsdSp菌株中，具有7个以上甘露糖残基的糖链与重组野生型菌株HpOCH2-MsdSp相比减少(图8的B和E)。当用α-1，2-甘露糖苷酶处理从重组野生型菌株和Hpoch2Δ突变株分离的糖链时，α-1，2-甘露糖苷酶将HpOCH2-MsdSp菌株的糖链转变为具有5个和6个甘露糖残基的糖链，而Hpoch2Δ-MsdSp菌株转变为具有5个甘露糖残基的糖链(图8的C和F)。这些结果揭示了当异源α-1，2-甘露糖苷酶导入多形汉逊氏酵母时，野生型菌株仍然由多形汉逊氏酵母HpOch2蛋白形成酵母特异的α-1，6-甘露糖键，因此表明为合成人型N-聚糖，应该基本上剔除了多形汉逊氏酵母HpOCH2基因。因此，本发明开发的具有缺陷HpOCH2基因的Hpoch2Δ突变株能有效作为生产具有人相容糖链的治疗性重组糖蛋白的宿主。此外，当各种糖链修饰酶在Hpoch2Δ突变株中表达时，它们复原具有在人体中无免疫原性的各种糖部分。因此，Hpoch2Δ突变株对开发生产生理活性增加和具有无免疫原性糖部分的新糖蛋白宿主的糖工程非常有用。

工业实用性

由于多形汉逊氏酵母已在世界范围内被批准作为大量生产重组肝炎疫苗的宿主系统，待在多形汉逊氏酵母中表达的重组蛋白具有被开发为生物制剂的高潜力。如上面实施例所述，在本发明中开发的多形汉逊氏酵母Hpoch2基因具有缺陷的Hpoch2Δ突变株中，外链延伸的起始被阻止，从而阻止酵母特异性α-1，6-甘露糖连续添加。因此，多形汉逊氏酵母突变株可以用作生产目标糖蛋白的宿主，其中目标糖蛋白具有与通过分泌途径生产的人糖蛋白接近的糖链结构形式。而且，如上所述，Hpoch2Δ突变株成为开发可以用作大量生产治疗价值重组糖蛋白宿主的各种多形汉逊氏酵母菌株的糖工程中的基础。因此，该Hpoch2Δ突变株在在相关工业领域中非常有用。

                                 序列表

<110>韩国生命工学研究院

<120>编码α1，6-甘露糖基转移酶的新的多形汉逊氏酵母基因和用同一基因有缺陷的多形汉逊氏酵母突变株生产重组糖蛋白的方法

<160>14

<170>KopatentIn 1.71

<210>1

<211>1351

<212>DNA

<213>Hansenula polymorpha

<220>

<221>CDS

<222>(10)..(1293)

<400>1

cggtgaaga atg gtg tat ttt tta aat ttc atg tca ata acc aat gtc ccg    51

          Met Val Tyr Phe Leu Asn Phe Met Ser Ile Thr Asn Val Pro

            1               5                  10

gtg ctg aag cgc gcg cga ctc tac atg gcg acg aat cgc cgg ctg gtg      99

Val Leu Lys Arg Ala Arg Leu Tyr Met Ala Thr Asn Arg Arg Leu Val

 15                  20                  25                  30

gtt gtt ctt gtg gtg ctg ctg tac tgg gtg gtc cag aac gtt tgg acg     147

Val Val Leu Val Val Leu Leu Tyr Trp Val Val Gln Asn Val Trp Thr

                 35                  40                  45

tgg agc cct ggg acg cgc gat ttg gcc caa gtg gac gcg aag atc gag     195

Trp Ser Pro Gly Thr Arg Asp Leu Ala Gln Val Asp Ala Lys Ile Glu

             50                  55                  60

gcc gag cta aac tcg aat cta cat act ttt gga gcg cat ttg cgc cac     243

Ala Glu Leu Asn Ser Asn Leu His Thr Phe Gly Ala His Leu Arg His

         65                  70                  75

tta aac cgg ctt ccg gca gag tcg gcc acc ctg cgt gaa aaa ctc acc     291

Leu Asn Arg Leu Pro Ala Glu Ser Ala Thr Leu Arg Glu Lys Leu Thr

     80                  85                  90

ttc tat ttc cca tat tat cct gaa aag ccc gtg ccg aac cag atc tgg     339

Phe Tyr Phe Pro Tyr Tyr Pro Glu Lys Pro Val Pro Asn Gln Ile Trp

 95                 100                 105                 110

cag aca tgg aag gtc gat ctc gaa gac gac aac ttc ccc aag cag tac     387

Gln Thr Trp Lys Val Asp Leu Glu Asp Asp Asn Phe Pro Lys Gln Tyr

                115                 120                 125

aga cgg ttt cag aag acg tgg gtc gag aaa aat cca gac tac gtg tac     435

Arg Arg Phe Gln Lys Thr Trp Val Glu Lys Asn Pro Asp Tyr Val Tyr

            130                 135                 140

cac ctg att ccg gac tct gtg att gag gac ttt gtg gcg agt ttg tac     483

His Leu Ile Pro Asp Ser Val Ile Glu Asp Phe Val Ala Ser Leu Tyr

        145                 150                 155

gcg aac gtg ccg gag gtg gtc aga gcg tac cag ctg ctt ccg aaa aat     531

Ala Asn Val Pro Glu Val Val Arg Ala Tyr Gln Leu Leu Pro Lys Asn

    160                 165                 170

atc atg aag gcg gat ttt ttc cgg tat ttg gtg atc tac gcg cgc gga     579

Ile Met Lys Ala Asp Phe Phe Arg Tyr Leu Val Ile Tyr Ala Arg Gly

175                 180                 185                 190

ggc acc tac tca gac atg gac acg gtg tgt tta aag ccg atc aag gac     627

Gly Thr Tyr Ser Asp Met Asp Thr Val Cys Leu Lys Pro Ile Lys Asp

                195                 200                 205

tgg gcc acg ttt gat cgc gac ctg atc cac gct gcc gac aat aag gcc     675

Trp Ala Thr Phe Asp Arg Asp Leu Ile His Ala Ala Asp Asn Lys Ala

            210                 215                 220

gat ctc tcc cag ata gat cca gaa gca aga acc acg cct gtg ggg ctg     723

Asp Leu Ser Gln Ile Asp Pro Glu Ala Arg Thr Thr Pro Val Gly Leu

        225                 230                 235

gtg att ggc att gag gcc gac ccg gac agg ccc gac tgg cac gag tgg     771

Val Ile Gly Ile Glu Ala Asp Pro Asp Arg Pro Asp Trp His Glu Trp

    240                 245                 250

ttc tcg cgc aga ctg cag ttc tgc cag tgg acg atc cag gcg aag ccg     819

Phe Ser Arg Arg Leu Gln Phe Cys Gln Trp Thr Ile Gln Ala Lys Pro

255                 260                 265                 270

gga cac ccg ctg ctg cgc gag ctg atc atc cgg atc gtg gag gag acg     867

Gly His Pro Leu Leu Arg Glu Leu Ile Ile Arg Ile Val Glu Glu Thr

                275                 280                 285

ttc cgc aaa cag cac atg ggc gtt ttg aaa aga gtg gaa ggc aag gac     915

Phe Arg Lys Gln His Met Gly Val Leu Lys Arg Val Glu Gly Lys Asp

            290                 295                 300

tcg ggc gca gat atc atg cag tgg aca gga ccg ggg ata ttt aca gac     963

Ser Gly Ala Asp Ile Met Gln Trp Thr Gly Pro Gly Ile Phe Thr Asp

        305                 310                 315

act ctg ttt gat tat ctg aac aat gtg gcg agc gac ggc aag ttg ggc    1011

Thr Leu Phe Asp Tyr Leu Asn Asn Val Ala Ser Asp Gly Lys Leu Gly

    320                 325                 330

gac ggg tac ggc gtg ggg tcg ttg tat tgg cgc aag cac ggc aaa tat    1059

Asp Gly Tyr Gly Val Gly Ser Leu Tyr Trp Arg Lys His Gly Lys Tyr

335                 340                 345                 350

aag ctg aaa aag aca gaa att aac aag aat aac gag cca ttg cat tct    1107

Lys Leu Lys Lys Thr Glu Ile Asn Lys Asn Asn Glu Pro Leu His Ser

                355                 360                 365

gag gac cag ctt atc aac tgg agg tcg ctg acc aac atg gac aag cca    1155

Glu Asp Gln Leu Ile Asn Trp Arg Ser Leu Thr Asn Met Asp Lys Pro

            370                 375                 380

aag atc atg ggg gac gta atg gtg tta cca atc acg agc ttt agt ccg    1203

Lys Ile Met Gly Asp Val Met Val Leu Pro Ile Thr Ser Phe Ser Pro

        385                 390                 395

aac gtg ggg cac atg ggc tca aag agc agc tca gat agg ctg gca ttt    1251

Asn Val Gly His Met Gly Ser Lys Ser Ser Ser Asp Arg Leu Ala Phe

    400                 405                 410

gtg gag cat tta ttt tct ggc agc tgg aag cca aaa aac aaa taggaaa    1300

Val Glu His Leu Phe Ser Gly Ser Trp Lys Pro Lys Asn Lys

415                 420                 425

aataaataat tagctgcatt ttagataatt ctcatgagca ggcacagaac g           1351

<210>2

<211>428

<212>PRT

<213>Hansenula polymorpha

<400>2

Met Val Tyr Phe Leu Asn Phe Met Ser Ile Thr Asn Val Pro Val Leu

  1               5                  10                  15

Lys Arg Ala Arg Leu Tyr Met Ala Thr Asn Arg Arg Leu Val Val Val

             20                  25                  30

Leu Val Val Leu Leu Tyr Trp Val Val Gln Asn Val Trp Thr Trp Ser

         35                  40                  45

Pro Gly Thr Arg Asp Leu Ala Gln Val Asp Ala Lys Ile Glu Ala Glu

     50                  55                  60

Leu Asn Ser Asn Leu His Thr Phe Gly Ala His Leu Arg His Leu Asn

 65                  70                  75                  80

Arg Leu Pro Ala Glu Ser Ala Thr Leu Arg Glu Lys Leu Thr Phe Tyr

                 85                  90                  95

Phe Pro Tyr Tyr Pro Glu Lys Pro Val Pro Asn Gln Ile Trp Gln Thr

            100                 105                 110

Trp Lys Val Asp Leu Glu Asp Asp Asn Phe Pro Lys Gln Tyr Arg Arg

        115                 120                 125

Phe Gln Lys Thr Trp Val Glu Lys Asn Pro Asp Tyr Val Tyr His Leu

    130                 135                 140

Ile Pro Asp Ser Val Ile Glu Asp Phe Val Ala Ser Leu Tyr Ala Asn

145                 150                 155                 160

Val Pro Glu Val Val Arg Ala Tyr Gln Leu Leu Pro Lys Asn Ile Met

                165                 170                 175

Lys Ala Asp Phe Phe Arg Tyr Leu Val Ile Tyr Ala Arg Gly Gly Thr

            180                 185                 190

Tyr Ser Asp Met Asp Thr Val Cys Leu Lys Pro Ile Lys Asp Trp Ala

        195                 200                 205

Thr Phe Asp Arg Asp Leu Ile His Ala Ala Asp Asn Lys Ala Asp Leu

    210                 215                 220

Ser Gln Ile Asp Pro Glu Ala Arg Thr Thr Pro Val Gly Leu Val Ile

225                 230                 235                 240

Gly Ile Glu Ala Asp Pro Asp Arg Pro Asp Trp His Glu Trp Phe Ser

                245                 250                 255

Arg Arg Leu Gln Phe Cys Gln Trp Thr Ile Gln Ala Lys Pro Gly His

            260                 265                 270

Pro Leu Leu Arg Glu Leu Ile Ile Arg Ile Val Glu Glu Thr Phe Arg

        275                 280                 285

Lys Gln His Met Gly Val Leu Lys Arg Val Glu Gly Lys Asp Ser Gly

    290                 295                 300

Ala Asp Ile Met Gln Trp Thr Gly Pro Gly Ile Phe Thr Asp Thr Leu

305                 310                 315                 320

Phe Asp Tyr Leu Asn Asn Val Ala Ser Asp Gly Lys Leu Gly Asp Gly

                325                 330                 335

Tyr Gly Val Gly Ser Leu Tyr Trp Arg Lys His Gly Lys Tyr Lys Leu

            340                 345                 350

Lys Lys Thr Glu Ile Asn Lys Asn Asn Glu Pro Leu His Ser Glu Asp

        355                 360                 365

Gln Leu Ile Asn Trp Arg Ser Leu Thr Asn Met Asp Lys Pro Lys Ile

    370                 375                 380

Met Gly Asp Val Met Val Leu Pro Ile Thr Ser Phe Ser Pro Asn Val

385                 390                 395                 400

Gly His Met Gly Ser Lys Ser Ser Ser Asp Arg Leu Ala Phe Val Glu

                405                 410                 415

His Leu Phe Ser Gly Ser Trp Lys Pro Lys Asn Lys

            420                 425

<210>3

<211>36

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>primer 168Not-N

<400>3

aaggaaaaaa gcggccgccg gtgaagaatg gtgtat                                36

<210>4

<211>39

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>primer 168Not-C

<400>4

ttttcctttt gcggccgccg ttctgtgcct gctcatgat                             39

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>primer UNfor

<400>5

ggatccccgg gtaccgagct                                                  20

<210>6

<211>20

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>primer UNrev

<400>6

caccggtagc taatgatccc                                                  20

<210>7

<211>20

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>primer UCfor

<400>7

cgaacatcca agtgggccga                                                  20

<210>8

<211>20

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>primer UCrev

<400>8

ctggcgaaag ggggatgtgc                                                  20

<210>9

<211>20

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>primer 168Nfor

<400>9

ggcggatatg gggcttcgcc                                                  20

<210>10

<211>40

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>primer 168Nrev

<400>10

agctcggtac ccggggatcc cgttccaggg ctccacgtcc                            40

<210>11

<211>40

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>primer 168Cfor

<400>11

gcacatcccc ctttcgccag ccgatcacga gcttcagtcc                            40

<210>12

<211>20

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>primer 168Crev

<400>12

cgtcgtccgg gcccagttcg                                                  20

<210>13

<211>33

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>primer for the amplification of alpha1，2-manosidase in

     Aspergillus saitoi

<400>13

ggggaattca aaaaaatggt ggtcttcagc aaa                                   33

<210>14

<211>69

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>primer for the amplification of alpha1，2-manosidase in

     Aspergillus saitoi

<400>14

gggccatggt cacaattcat catgcgcata gtcaggaaca tcgtatgggt atgtactact    60

cacccgcac                                                            69

                  PCT/RO/134表

  申请人或代理人的案卷号  PCTA9407-2  国际申请号  PCT/KR2004/001819

           关于保藏微生物或其它生物材料的说明

 A.下面作出的说明涉及说明书第11页、25-28行中提及的保藏微生物或其它生 物材料 B.保藏的鉴定                                    更多保藏在附加页□ 保藏机构的名称 韩国典型培养物保藏中心 保藏机构的地址(包括邮政编码和国家) 韩国共和国大田305-333，宇松区欧洞#52， 保藏日期2004年1月15日  保藏号KCTC 10583BP C.另外的说明(如果不适用，保持空白)          这个信息在附加页上继续□  D.作出说明的指定国(如果该说明不是为所有指定国)  E.分开提供说明(如果不适用，保持空白)  下列说明随后将提交到国际局(详细说明该说明的一般性质e.q.，“保藏号”  )  仅供受理局使用  □该页与国际申请一起收到  授权官员  仅供国际局使用  □该页由国际局收到于：  授权官员

  申请人或代理人的案卷号  PCTA9407-2  国际申请号  PCT/KR2004/001819

                关于保藏微生物或其它生物材料的说明

 A.下面作出的说明涉及说明书第13页、1-4行中提及的保藏微生物或其它生物 材料 B.保藏的鉴定                                      更多保藏在附加页□ 保藏机构的名称 韩国典型培养物保藏中心 保藏机构的地址(包括邮政编码和国家) 韩国共和国大田305-333，宇松区欧洞#52 保藏日期2004年1月15日  保藏号KCTC 10584BP C.另外的说明(如果不适用，保持空白)           这个信息在附加页上继续□ D.作出说明的指定国(如果该说明不是为所有指定国) E.分开提供说明(如果不适用，保持空白) 下列说明随后将提交到国际局(详细说明该说明的一般性质e.q.，“保藏号”)  仅供受理局使用  □该页与国际申请一起收到  授权官员  仅供国际局使用  □该页由国际局收到于：  授权官员