猪瘟病毒E2蛋白在大肠杆菌中表达及免疫原性分析

摘要

猪瘟(Classical swine fever，CSF)被国际兽医组织OIE列为A类传染病，由猪瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)引起。近些年来，中国因感染CSFV死亡的猪的数量占全部疫病致死猪数量的三分之一以上，对国内养猪业造成巨大的经济损失和资源浪费。中国通常采用接种猪瘟弱毒疫苗等防控措施来控制猪瘟疫情的爆发。猪瘟疫情由大规模流行逐渐转化为无规律散发流行，尽管免疫时的疫苗剂量和频率都有所增加，但仍未有效及时地控制住猪瘟的蔓延。由于滥用猪瘟弱毒疫苗以及野毒株的变异，猪瘟疫情出现慢性、隐性感染，导致难以区分疫苗免疫猪与野毒感染猪，从而使疫情更加难以控制。因此，研制能鉴别诊断、安全高效的新型基因工程亚单位疫苗是全世界养猪业的迫切需求。
　　为制备具有免疫原性的CSFV E2蛋白，并对其进行纯化和免疫原性分析。将E2基因插入原核表达载体pET-28a中，构建重组质粒pET-28a-E2。并将质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达，经SDS-PAGE电泳和Western-Blot结果证明，本试验成功表达出可溶的E2蛋白。分别对IPTG的终浓度、诱导温度及诱导时间进行优化，结果表明当IPTG终浓度为0.1mmol/L在18℃的条件下诱导16h，E2蛋白的可溶表达量最高。通过分子筛一步纯化E2蛋白，其最终质量浓度为0.5g/L。Western-Blot和ELISA结果证明，纯化后的E2蛋白在变性及非变性条件下均可被猪瘟阳性血清特异性识别，表明纯化后的E2蛋白成功表达，并且活性良好。将纯化后的E2蛋白分别添加弗氏佐剂、gel01佐剂和纳米材料等进行乳化免疫BALB/C小鼠，每周采集小鼠血清测定抗体效价、抗体消长规律并进行中和抗体试验，结果显示，免疫后小鼠血清中抗体水平不断增加并在56天时达到最高，表明E2蛋白免疫原性良好。综上，成功利用大肠杆菌BL21(DE3)菌株表达了可溶性E2蛋白，且纯化后的E2蛋白免疫原性良好。

目录

声明

致谢

论文说明

摘要

第一部分 文献综述

1 猪瘟研究进展

1．1 猪瘟病毒的发现及分类

1．2 猪瘟基因和蛋白结构及功能

1．3 猪瘟病毒病原学和流行病学特征

1．4 猪瘟病毒感染和致病机制

1．5 猪瘟病毒的诊断和检测

2 猪瘟疫苗的研究进展

2．1 传统猪瘟疫苗

2．2 新型猪瘟疫苗

2．3 猪瘟免疫的预防和控制

第二部分 研究内容

第一章 猪瘟病毒E2蛋白原核表达载体的构建及蛋白诱导表达条件的优化

1 引言

2 材料与方法

3 试验结果

4 讨论

第二章 猪瘟病毒E2蛋白的纯化及免疫评价

1 引言

2 材料与方法

3 试验结果

4 讨论

全文总结

参考文献