西瓜GAPDH基因家族的鉴定与功能的初步分析

摘要

西瓜是我国重要的经济作物，其栽培面积和产量均居世界第一位。近年来，随着设施栽培面积的扩大，选育高抗、广适和优质的西瓜品种已成为现在亟待解决的问题之一。目前，西瓜的全基因组测序已经完成，但后续关于基因功能的研究相对落后，尤其是针对西瓜抗逆相关基因功能的研究仍不明了。此外，西瓜遗传背景相对狭窄。因此，研究和利用抗性相关基因，不但可以指导西瓜抗逆新品种的选育，并能为抗性机制的解析提供理论基础。
　　3-磷酸甘油醛脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)是细胞内糖代谢过程中一个组成性表达蛋白，参与细胞中糖酵解途径，与ATP的合成密切相关。通常GAPDH在生物体内的含量较为丰富，它也通常被看作是一种内参蛋白。本文通过筛选和鉴定葫芦科主要作物西瓜、甜瓜、黄瓜和南瓜的GAPDH基因家族成员，比较了不同物种间的家族进化关系;同时针对西瓜GAPDH基因家族在非生物胁迫和生物胁迫等方面的非糖酵解功能进行了初步验证，并克隆了西瓜GAPDH家族中的逆境响应基因ClaGAPDH3、ClaGAPDH4和ClaGAPDH5;为了进一步验证其功能，初步构建了GAPDH4的过量表达载体和GFP载体，并转化拟南芥获得了T0代种子。目前本文关于GAPDH基因功能的主要研究结果如下:
　　(1)确定了葫芦科主要作物西瓜、甜瓜、黄瓜和南瓜GAPDH基因家族成员的数量、系统进化关系、基因结构、染色体分布和共线性关系。以模式植物拟南芥8个AtGAPDH基因蛋白质序列在葫芦科作物数据库中查找四种主要的葫芦科作物西瓜、甜瓜、黄瓜和南瓜的GAPDH成员，并将他们分别命名为西瓜ClaGAPDH1-ClaGAPDH8、甜瓜CmeGAPDH1-CmeGAPDH7、黄瓜CsaGAPDH1-CsaGAPDH8、南瓜CmoGAPDH1-CmoGAPDH14。据系统进化关系分析，可将西瓜、甜瓜、黄瓜和南瓜GAPDH基因家族分四个亚家族，为SubⅠ、SubⅡ、SubⅢ、SubⅣ(分别具有不同的功能域:Gp_dh_N、Gp_dh_C、CP12和Adledh)。对其基因结构进行分析，则发现在不同的亚家族中各成员所含的内含子个数有一定的差异存在，而在同一个亚家族中的成员，他们所含有的内含子个数基本相同，并且他们的内含子和外显子的组织结构高度相似。不同的亚家族中的GAPDH基因家族各成员所含的蛋白基序个数有一定的差异存在，而在同一个亚家族中的GAPDH基因家族成员的保守基序的种类、数目和组织形式具有很强的一致性。染色体分布分析，西瓜8个GAPDH基因主要分布在Chr2、Chr3、Chr5、Chr9和Chr11这5条染色体上，甜瓜7个GAPDH基因主要分布在Chr3、Chr5、Chr6、Chr7、Chr11和Chr12这6条染色体上，在黄瓜8个GAPDH基因中主要分布在Chr1、Chr2、Chr3、Chr4、Chr6和Chr7这6条染色体上，在南瓜中有14个GAPDH基因，分布在12条染色体上，其中Chr11的GAPDH基因成员最多。
　　(2)本试验对西瓜GAPDH基因在不同处理、不同时期及不同组织中进行了半定量qRT-PCR表达情况分析，发现在西瓜中通过不同时期的组织表达分析情况。其中ClaGAPDH1、ClaGAPDH2、ClaGAPDH5和ClaGAPDH6四个基因在西瓜叶片中表现出显著上调，ClaGAPDH6，ClaGAPDH7在花中表达上调，ClaGAPDH1、ClaGAPDH2在根中无显著表达。胁迫处理分析，胁迫条件下西瓜GAPDH基因的表达变化不同，ClaGAPDH3、ClaGAPDH4和ClaGAPDH5在不同的处理下具有广泛的响应，而其他成员的表达丰度相对较低。说明GAPDH基因能够被NaCl、PEG、ABA、热和冷多种逆境胁迫诱导表达。
　　(3)克隆西瓜GAPDH家族中的逆境响应基因ClaGAPDH3、ClaGAPDH4和ClaGAPDH5;通过同源克隆获得了西瓜的ClaGAPDH3、ClaGAPDH4和ClaGAPDH5基因序列。经过PCR扩增后获得目的片段，均在1000bp左右位置，其大小和参考基因组基本相符合，对西瓜SubⅢ类ClaGAPDH3、ClaGAPDH4和ClaGAPDH5基因的同源比对分析发现，它们具有高度的相似性，且均含有结合NAD(P)-N端的Gp_dh_N功能域和C端催化域Gp_dh_C，同时所有的西瓜GAPCs类基因均含有保守的丝氨酸残基。Pfam分析表明154位点的丝氨酸具有氧化修饰特性。

目录

声明

致谢

摘要

1 前言

2 非生物胁迫在植物上的研究

2．1 植物非生物胁迫的种类

2．2 植物非生物胁迫应答的相关分子机理

3 GAPDH基因家族的研究及其在非生物胁迫下的调控机制

3．1 GAPDH基因家族的生物学特性和分类

3．2 GAPDH参与糖酵解的代谢途径

3．3 GAPDH的非糖酵解途径功能的研究

4 本研究的主要内容

4．1 研究内容

4．2 研究目的和意义

1 试验方法

1．1 常用生物学数据库

1．2 葫芦科主要作物中GAPDH基因的鉴定和分析

1．3 葫芦科主要作物中GAPDH基因的结构分析

1．4 葫芦科主要作物中GAPDH基因保守基序的分析

1．5 葫芦科主要作物中GAPDH基因的染色体位置分析

2 结果与分析

2．1 GAPDH基因家族的筛选与鉴定

2．2 葫芦科主要作物中GAPDH基因的进化关系

2．3 葫芦科主要作物中GAPDH基因的结构分析

2．4 葫芦科主要作物中GAPDH基因保守基序的分析

2．5 葫芦科主要作物中GAPDH基因的染色体位置分析

3 讨论

第三章 西瓜GAPDH基因家族的表达分析

1 材料与方法

1．1 试验材料与处理

1．2 主要实验仪器

1．3 试验方法

1．4 荧光定量PCR的检测

2 结果与分析

2．1 组织表达分析

2．2 胁迫表达分析

3 讨论

1．1 试验材料

1．2 试验试剂与仪器

1．3 试验方法

2 结果与分析

2．1 目地基因的克隆和序列分析

2．2 蛋白序列分析

2．3 西瓜GAPDH5基因的表达载体构建

2．4 西瓜GAPDH5基因的GFP载体构建

2．5 西瓜GAPDH5基因的转化

3 讨论

参考文献

附件