禽腺病毒血清4型新型检测方法的建立

摘要

2015年7月起，由禽腺病毒血清4型(FAdV-4)中国流行株引起的以剖检病变主要为心包膜内有浅黄色的积液、肝脏黄染、肿大和出血为特征的鸡肝炎-心包积液综合征(HHS)在中国山东、河南、安徽和江苏等省份大面积流行。该病主要危害3-5周龄肉鸡，表现为突发性死亡，死亡率20％-60％，最高可达80％，为中国养禽业带来很大的经济损失。本课题组与国内其他研究表明，引起此次HHS流行的FAdV-4中国流行株属于新的基因型，与早期报道的致病性和非致病性的FAdV-4相比，FAdV-4中国流行株的基因组和主要结构基因有较明显的差异，氨基酸的突变和缺失主要集中在fiber2蛋白。
　　为了客观准确地监测FAdV-4中国流行株在鸡群中的流行状况，本研究从血清学及分子生物学方面建立了新型的FAdV-4检测方法，对鸡群进行监测，以期为HHS疫情的监测防控提供方法。
　　1.禽腺病毒血清4型RPA-LFD快速检测方法的建立
　　为了建立一种快速、灵敏、简便的FAdV-4现场检测方法，本研究将重组酶聚合酶扩增(RPA)与胶体金侧向流试纸条(LFD)技术联合，设计针对FAdV-4hexon基因的特异性RPA引物，上、下游引物的5'端分别进行6-羧基荧光素(FAM)和生物素(Biotin)标记。通过对引物浓度、RPA反应时间和温度等条件的优化，建立了一种可用于FAdV-4现场检测的RPA-LFD方法。该检测方法在25-45℃恒温反应15min即可实现对FAdV-4目的基因片段的有效扩增，RPA扩增产物用胶体金侧向流试纸条进行检测，检测结果肉眼可见。该方法的最低检测限为100拷贝，敏感性是常规PCR的100倍，且与其他常见禽病病原核酸检测无交叉反应。结果显示，本研究建立的RPA-LFD可用于FAdV-4的临床快速检测，为FAdV-4感染的流行病学检测提供了一种有效方法。
　　2.基于FAdV-4中国流行株fiber2蛋白的间接ELISA抗体检测方法的建立
　　为了建立用于禽腺病毒血清4型中国流行株的血清流行病学监测方法，本研究利用在大肠杆菌中表达的FAdV-4中国流行株fiber2C-末端蛋白作为包被抗原，建立了检测抗FAdV-4中国流行株抗体的间接ELISA方法。所建立方法的优化后的最佳条件为:抗原最适包被量为0.25μg/孔，包被时间为37℃1h，然后4℃过夜;被检血清的最佳稀释度为1∶800，作用时间为2h;二抗选用HRP标记的兔抗鸡IgY，稀释度为1∶4000，作用时间为1.5h;显色液TMB作用条件为室温5min。所建立ELISA的判定标准为:样品的S/P值大于或等于0.0553判为阳性，小于0.0418判为阴性。用建立的ELISA方法对抗鸡新城疫病毒、禽流感病毒、传染性法氏囊病病毒、传染性支气管炎病毒、减蛋综合征病毒阳性血清进行了检测，均无交叉反应，表明该方法有较好的特异性，组内和组间重复的最大变异系数为5.6％和5.7％，所建立的ELISA方法重复性良好。用所建立的ELISA方法对50份来自于疑似患肝炎-心包积液合征病鸡的血清样品进行检测，阳性检出率为98％，与FAdV-4病原学检测结果符合率为100％。结果表明，本研究所建立的ELISA方法可用于抗FAdV-4中国流行株抗体的检测，为肝炎-心包积液综合征病监测和流行病学调查提供了方法。
　　3.抗Hexon469-775aa蛋白单克隆抗体的制备及鉴定
　　本研究以纯化的FAdV-4全病毒为免疫原免疫小鼠制备单克隆抗体，用Ⅰ群禽腺病毒hexon保守区(469-775aa)重组蛋白筛选出4株单克隆抗体。4株单克隆抗体亚类均为IgG2b，且能够特异性识别FAdV-4、FAdV-8b、FAdV-11的hexon蛋白，与新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、传染性法师囊病毒、禽流感病毒均不发生特异性反应。结果表明，hexon蛋白469-775aa区域携带有禽腺病毒群特异性抗原，重组hexon469-775aa蛋白和筛选得到的单克隆抗体能够用来建立多种临床相关的禽腺病毒的检测方法，并为评价禽腺病毒免疫或感染后产生的抗体水平打下基础。
　　4.禽腺病毒双抗体夹心ELISA检测抗原的方法建立
　　本研究以抗hexon469-775aa单克隆抗体为捕获抗体，对各反应条件进行了优化，建立了检测禽腺病毒的双抗体夹心ELISA方法。所建立的ELISA方法特异性良好，与传染性法氏囊病毒、传染性支气管炎病毒、新城疫病毒、H9亚型禽流感病毒、减蛋综合征病毒均无交叉反应。批间和批内的重复试验变异系数均小于10％，表明建立的ELISA方法稳定性良好。用所建立的双抗体夹心ELISA方法对50份临床样品进行检测，检测结果与禽腺病毒PCR病原检测结果相符。结果表明，本研究建立的双抗体夹心ELISA方法可用于临床禽腺病毒感染情况的监测，为中国禽腺病毒感染的流行病学调查奠定了基础。

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致谢

英文缩写词表

摘要

文献综述

1 禽腺病毒生物学特点

1．1 禽腺病毒的形态特征及理化性质

1．2 禽腺病毒主要蛋白及功能

2 禽腺病毒血清4型的流行病学研究

3 禽腺病毒的检测方法

3．1 病原的分离鉴定

3．2 血清学检测方法

3．3 分子生物学检测方法

4 重组酶聚合酶扩增技术

5 本研究的目的与意义

试验研究

1 材料与方法

2 结果

3 小结与讨论

试验二：基于FAdV-4中国流行株Fiber2蛋白的间接ELISA抗体检测方法的建立

1 材料与方法

2 结果

3 小结与讨论

试验三：抗禽腺病毒hexon469-775aa单克隆抗体的制备与鉴定

1 材料与方法

2 结果

3 小结与讨论

试验四．禽腺病毒双抗体夹心ELISA检测抗原的方法建立

1 材料与方法

2 结果

3 小结与讨论

全文总结

参考文献

附作者读研期间发表文章