新型纤维二糖磷酸化酶(CBP)的性质与热纤梭菌CBP酵母表面展示研究

摘要

如何有效的利用纤维素资源来高效的生产生物质产品是目前研究的热点问题，近年来已建立的由纤维素产出淀粉的新途径，对于减少纤维素的浪费以及提供可食淀粉具有重要意义。在纤维素转化淀粉途径中，纤维二糖磷酸化酶(CBP)担负着由β型糖苷键转为α型糖苷键的重要功能，为该体系中的关键酶。为了优化纤维素转淀粉体系中的关键酶，以及缩减成本促进其应用的角度，本研究进行了具有优良性质新型CBP酶的发现及功能鉴定、对CBP进行酿酒酵母表面展示等方面的研究，主要获得以下结果:
　　(1)从KEGG数据库中搜索到来自Thermosipho africanus TCF52B中注释为CBP功能的蛋白THA_1941，尽管该蛋白与所有已知GH94酶都具有非常低的氨基酸同源性，但结构对比分析表明其二级结构具有CBP保守催化活性区域(α-α)6桶状结构域，因此选定THA_1941为候选CBP。
　　(2)在大肠杆菌BL21(DE3)中克隆表达THA_1941，进行功能活性的鉴定，确定其具有CBP的活性（命名为TaCBP），TaCBP最适温度为75℃，最适pH为7.5。除此之外，该酶可以使用纤维二糖和聚合度大于2的长链纤维寡糖作为葡萄糖受体，从G-1-P上释放磷酸盐，显示了TaCBP同时具有纤维寡糖磷酸化酶(CDP)的功能活性。
　　(3)对TaCBP进行催化效率（Kcat/Km）的测定，结果显示纤维四糖和纤维五糖分别是其磷解方向和合成方向反应的最佳底物，并且合成方向的催化速率要远远大于磷解方向催化速率，该酶可能是合成各种寡糖的潜在催化剂。
　　(4)对TaCBP和目前已构建的纤维素转化淀粉中来自Clostridium thermocellum的CBP(CtCBP)进行淀粉转化能力的比较，相对于TaCBP，CtCBP有相对较强的合成淀粉的能力，因此本研究选择CtCBP进行其在酿酒酵母表面上的展示工作。
　　(5)利用酿酒酵母细胞a-凝集素展示系统，构建CtCBP与酵母展示质粒pYD1的重组质粒，转化酿酒酵母细胞EBY100，诱导CtCBP在酿酒酵母表面的展示表达，对CtCBP展示菌株重组酶进行酶活性测定，60h为最佳的诱导时间，展示重组酶的最适pH为7.0，最适温度为65℃，拥有较好的热稳定性，65℃下保温6h仍可保留原活性的91％。展示重组酶显现了一定的淀粉合成能力，由纤维二糖转化淀粉转化率为16.3％，有实际应用前景。
　　本研究对发现的新型TaCBP进行了功能鉴定，发现其同时具有CBP和CDP的功能，且对于寡糖为底物的合成反应有着独特的催化能力;CtCBP的表面展示显示了其工业应用的潜在价值，为纤维素转化淀粉体系提供了实际化应用的基础。

目录

声明

致谢

摘要

1 文献综述

1．1．2 纤维素的生物降解

1．1．3 纤维素的生物质转化

1．2 纤维二糖磷酸化酶研究进展

1．2．1 纤维二糖磷酸化酶的功能机制

1．2．2 纤维二糖磷酸化酶的来源

1．2．3 纤维二糖磷酸化酶的酶学性质

1．2．4 纤维二糖磷酸化酶的应用

1．3 酵母表面展示技术生产全细胞催化剂的进展

1．3．1 常用展示系统

1．3．2 运用展示技术生产全细胞催化剂

2 引言

3 材料与方法

3．1 菌株及质粒

3．2 主要培养基及试剂的配制

3．3 主要仪器及条件

3．4 大肠杆菌重组质粒pET21a-THA_1941的构建

3．4．1 酶切酶连构建质粒

3．4．2 大肠杆菌DH5α感受态的制备

3．4．4 重组质粒的验证及测序

3．5 TaCBP的诱导表达及纯化

3．5．1 TaCBP的诱导表达

3．5．2 TaCBP的纯化

3．5．3 蛋白浓度测定

3．6 TaCBP基本酶学性质的测定

3．6．1 CBP酶活性合成方向的测定方法

3．6．2 CBP酶活性磷解方向的测定方法

3．6．3 TaCBP最适pH的测定

3．6．4 TaCBP最适温度的测定

3．6．5 TaCBP热稳定性的测定

3．6．6 TaCBP底物特异性的测定

3．6．7 TaCBP酶动力学测定

3．7 TaCBP与CtCBP生成淀粉能力的比较

3．7．1 纤维二糖转化淀粉体系

3．7．2 硫酸-苯酚法测淀粉含量

3．8．1 酶切酶连构建重组质粒

3．8．2 酿酒酵母细胞感受态的制备

3．8．3 电转化酿酒酵母细胞

3．8．4 菌落PCR验证转化子

3．8．5 酿酒酵母的诱导表达

3．9 CtCBP展示菌株酶活性的测定

3．9．1 粗酶液的制备

3．9．2 CtCBP展示菌株最适pH的测定

3．9．3 CtCBP展示菌株最适温度的测定

3．9．4 CtCBP游离酶及CtCBP展示菌株热稳定性的测定

4 结果与分析

4．1 新型纤维二糖磷酸化酶(CBP)的发现及功能鉴定

4．1．1 候选CBP的发现

4．1．2 候选CBP的结构分析

4．1．3 THA_1941在大肠杆菌中的表达

4．1．5 TaCBP基本酶学性质的研究

4．1．6 TaCBP底物特异性的测定

4．1．7 TaCBP的CDP功能鉴定

4．1．8 TaCBP动力学参数的测定

4．2 TaCBP和CtCBP生成淀粉能力的比较

4．2．1 乙醇沉淀淀粉结果

4．2．2 碘液显色定性

4．2．3 硫酸苯酚法测定CtCBP实验组中淀粉生成量

4．2．4 CtCBP生成淀粉转化率的计算

4．3 CtCBP在酿酒酵母表面的展示

4．3．1 重组质粒的构建

4．3．2 酿酒酵母表面展示菌株的筛选及验证

4．3．3 CtCBP表面展示菌株基本酶学性质的测定

4．3．3 CtCBP表面展示菌株转化淀粉实验

5 结论与讨论

5．2．1 关于TaCBP双功能活性的讨论

5．2．2 一个适合转化淀粉体系的CBP理想性质探究

5．2．3 酿酒酵母表面展示CBP为降低用酶成本提供了新的途径

参考文献