壁虎多肽混合物A抗血管生成作用的实验研究

摘要

目的：观察壁虎多肽混合物 A（GPMA）抗肿瘤血管生成的作用,并探讨其机制。
　　方法：⑴建立鸡胚尿囊膜血管形成模型（CAM模型），采用一日龄受精种蛋50只温箱孵育到九日龄，随机分为5组，每组10只，分别为实验组（高、中、低壁虎多肽混合物）、阴性对照组和阳性对照组。在蛋壳上开窗暴露鸡胚尿囊膜，将提前制备好的甲基纤维素薄片放置于尿囊膜新生毛细血管区域，作为药物载体。然后给予实验组鸡胚不同浓度壁虎多肽。观察壁虎多肽对鸡胚尿囊膜新生血管的抑制作用；阴性对照组给予等量生理盐水，阳性对照组用5-氟尿嘧啶，48h后观察甲基纤维素薄片覆盖区及周围血管生成情况；⑵分离、培养人脐静脉内皮细胞（HUVEC），用倒置显微镜观察体外培养 HUVEC的形态变化，并用MTT比色法测定含不同浓度（0.4mg/mL、0.2mg/mL、0.1mg/mL、0.05mg/mL、0.025mg/mL）的壁虎多肽混合物 A对HUVEC增殖的影响；⑶培养人EC109肿瘤细胞，用免疫组化法观察0.2mg/mL和0.1mg/mL壁虎多肽混合物 A作用24h后对 EC109细胞 VEGF蛋白表达的影响；⑷建立小鼠H22移植肿瘤模型，用免疫组化法和 Western-blot法检测小鼠 H22移植肿瘤组织对VEGF蛋白表达的影响。
　　结果：①阴性对照组的大血管数量、血管密度、血管分支明显多于壁虎多肽组，管径也较壁虎多肽组粗，加入壁虎多肽高剂量组的CAM上只见极少数管径极细的大血管，血管分支明显减少，细小血管几乎不见，甚至出现溶血现象。壁虎多肽在40μg/egg时抑制率为90％，与对照组比差异有显著性。解剖显微镜下观察并计数全视野内的大小血管，用药组血管总数明显减少。②倒置显微镜下可见，正常人脐静脉内皮细胞贴壁单层生长，铺路石状单层梭形细胞排列，细胞为扁平多角形，边界清楚，胞浆丰富、胞核清晰可见，为圆形或椭圆形。加药24小时后，各药物组细胞排列紊乱，尤其5-FU阳性药物及大剂量药物组作用明显、细胞数量明显减少。MTT结果显示药物对其抑制作用随浓度、时间的增加而加强。③在体外 EC109肿瘤细胞培养实验中，免疫组化结果显示壁虎多肽混合物A在0.2mg/mL、0.1mg/mL剂量下均能明显降低EC109肿瘤细胞的VEGF的表达。④在小鼠 H22移植肿瘤模型，腹腔注射高（80mg/kg）、中（40mg/kg）、低（20mg/kg）剂量壁虎多肽混合物A，免疫组化和Western-blot实验结果显示壁虎多肽混合物A能抑制肿瘤组织中VEGF蛋白的产生。
　　结论：壁虎多肽混合物A可以抑制正常及肿瘤组织的血管增生，其抑制血管增生作用可能是通过抑制血管内皮或者肿瘤细胞VEGF的产生的结果。

目录

第1章 综述

1.1抗肿瘤血管生成的药物研究

1.2壁虎的实验研究

第2章 引言

第3章 材料与方法

3.1材料

3.2实验方法

第4章 结果

4.1 GEE层析结果

4.2GPMA影响CAM血管生成的结果

4.3GPMA对脐静脉内皮细胞作用的结果

4.4药物对EC109细胞VEGF蛋白表达的影响

4.5对小鼠H22组织VEGF蛋白表达的影响

第5章 讨论

5.1壁虎多肽混合物A制备与选用

5.2鸡胚与血管增生

5.3人脐静脉血管内皮细胞

5.4肿瘤与血管增生

第6章 结论

参考文献

附图

缩略语词汇表

致谢

攻读硕士学位期间的研究成果