羊源弗氏柠檬酸杆菌Ⅰ型菌毛FimA和FimH蛋白免疫原性分析

摘要

弗氏柠檬酸杆菌是一种典型的人-畜-鱼共患条件性致病菌。近年来，弗氏柠檬酸杆菌引起动物和人发病的报道较多，且常引起较严重的感染。黏附是病原微生物建立感染的关键环节，理论上阻断其黏附就可阻断病原菌对宿主的感染，从而达到预防的作用。为了探讨弗氏柠檬酸杆菌及其黏附素作为疫苗成分的免疫效力，本研究以弗氏柠檬酸杆菌及其Ⅰ型菌毛为研究对象，对其Ⅰ型菌毛相关基因的重组表达、羔羊感染模型、小鼠免疫保护效力、羔羊免疫保护效力等进行了系统研究，为该病抗体 ELISA快速检测方法的建立和新型疫苗的研制与开发奠定基础。具体研究内容以下：
　　（1）Ⅰ型菌毛黏附素 FimA和 FimH蛋白表达纯化。参照 GenBank登录号AJ508060.1上收录的弗氏柠檬酸杆菌FimA和FimH全基因核苷酸序列，分别设计合成两对引物，以弗氏柠檬酸杆菌总 DNA为模板，PCR扩增 FimA和 FimH基因，其片段大小分别为552bp和1005bp。将FimA和FimH基因分别插入原核表达载体 pET-28a(+)质粒，并成功构建了两个重组表达载体并将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导表达、SDS-PAGE分析和Western blotting鉴定，结果表明：FimA和 FimH蛋白均以包涵体的形式表达，分子量约为19 kDa和38 kDa。重组后的FimA和FimH蛋白均能被兔抗弗氏柠檬酸杆菌阳性血清特异性识别，表明两者均具有较好的反应原性。利用包涵体蛋白纯化试剂盒对重组蛋白进行提取后获得了纯化的重组蛋白。该试验为将 FimA和 FimH重组蛋白的进一步开发为诊断试剂抗原或亚单位疫苗抗原奠定基础。
　　（2）亚单位疫苗及蛋白与灭活菌体混合苗的小鼠免疫保护力评价。制备弗氏佐剂 FimA和 FimH亚单位疫苗及各蛋白与灭活菌体的混合疫苗。SPF级BALB/c小鼠免疫剂量为200μL/只，蛋白含量30μg/只。小鼠免疫保护实验结果表明对照组小鼠全部死亡；FimA、FimH和 FimA+FimH蛋白苗分别提供了10％（1/10）、20%（2/10）和40%（4/10）的保护率;灭活疫苗及蛋白与灭活菌体混合苗均可提供100%（10/10）的保护率。小鼠二次免疫后，经 ELISA检测抗体效价，结果显示 FimA、FimH或 FimA+FimH蛋白苗可诱导不同程度的抗体水平，且与灭活菌体联用作为抗原时还可增强灭活疫苗诱导抗体水平的能力。该研究在小鼠免疫保护试验的基础上证实弗氏柠檬酸的菌体灭活疫苗具有良好保护效力，重组 FimA和 FimH蛋白也均有一定的免疫保护效力。
　　（3）弗氏柠檬酸杆菌小尾寒羊感染模型的建立。将3-4月龄健康小尾寒羊6只，随机均分为3组（2只/组）。第1-3组分别按照3.0×109、1.0×109、3.3×108 CFU/只的剂量通过耳静脉注射弗氏柠檬酸杆菌 LK-1株菌液。结果表明，在14日的观察期内，第1组2只全部死亡，第2组2只死亡1只，第3组没有发生死亡；表明弗氏柠檬酸杆菌 LK-1株对小尾寒羊的静脉致死剂量介于1.0-3.0×109CFU之间。死亡羊只进行剖检，可见以各器官出血为特征的典型败血症性病理变化，与临床上自然发病羊的症状类似。其主要表现在肺脏、脾脏严重出血，脑组织轻度水肿、腹腔积液和心肌肿大出血等。弗氏柠檬酸杆菌羔羊感染模型的建立为进一步开展其致病机理研究、疫苗的效力检测等奠定基础。
　　（4）亚单位疫苗及蛋白与灭活菌体混合苗的羊免疫保护效力评价。根据MontanideTMGEL01 PR水溶性佐剂产品的说明书，分别制备含有GEL佐剂的3种弗氏柠檬酸杆菌疫苗： LK-1株灭活菌体疫苗、“FimA+FimH蛋白疫苗”、“FimA蛋白+FimH蛋白+LK-1株灭活菌体疫苗”，将3种疫苗分别通过肌肉注射2次免疫（间隔21日）羔羊，然后使用致死剂量的弗氏柠檬酸杆菌菌液1.5 mL（含有活菌数为2.43×109 CFU）进行耳静脉攻毒。结果表明，“FimA+FimH蛋白疫苗”可提供25%（1/4）的保护率， LK-1株灭活菌体疫苗可提供100%（4/4）的保护率，“FimA蛋白+FimH蛋白+灭活菌体疫苗”也可提供100%（4/4）的保护效率。本研究结果表明弗氏柠檬酸杆菌菌体灭活疫苗或在菌体疫苗中进一步添加FimA、FimH蛋白等亚单位成分能有效保护羔羊针对野生型强毒菌株的感染，这为羊柠檬酸杆菌病的疫苗研究与开发奠定基础。

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第1章 弗氏柠檬酸杆菌的研究进展

1.1 柠檬酸杆菌的命名与分类

1.2 弗氏柠檬酸杆菌的生物学特性

1.2.1 弗氏柠檬酸杆菌的生长特性

1.2.2 弗氏柠檬酸杆菌的吸附性及编码的酶类

1.3 弗氏柠檬酸杆菌的致病性

1.4 弗氏柠檬酸杆菌的耐药性

1.5 弗氏柠檬酸杆菌的致病机制

1.6 弗氏柠檬酸杆菌的预防与治疗

1.6.1 弗氏柠檬酸杆菌的预防

1.6.2 弗氏柠檬酸杆菌的治疗

1.7 实验目的和意义

第2章 羊源弗氏柠檬酸杆菌Ⅰ型菌毛FimA和FimH基因的原核表达与纯化

2.1 实验材料

2.1.1 实验动物

2.1.2 质粒和菌株

2.1.3 主要试剂与仪器设备

2.1.4 培养基和溶液配制

2.2 实验方法

2.2.1 羊源弗氏柠檬酸杆菌的复苏培养与鉴定

2.2.2 弗氏柠檬酸杆菌DNA模板的制备

2.2.3 目的基因的引物设计与合成

2.2.4 目的基因的PCR扩增

2.2.5 PCR扩增产物的检测

2.2.6 PCR扩增产物的回收

2.2.7 PCR扩增产物与表达载体的酶切与连接

2.2.8 连接产物的转化

2.2.9 重组质粒的鉴定

2.2.10 重组蛋白的诱导表达

2.2.11 SDS-PAGE分析

2.2.12 表达产物的纯化、复性和浓度测定

2.2.13 弗氏柠檬酸杆菌兔高免血清制备

2.2.14表达产物的Western blotting分析

2.3 实验结果

2.3.1 羊源弗氏柠檬酸杆菌的复苏培养与鉴定

2.3.2 FimA和FimH基因的PCR扩增结果

2.3.3 重组质粒的构建与双酶切鉴定

2.3.4 重组载体的序列测定分析

2.3.5 重组蛋白的诱导表达

2.3.6 表达产物的纯化、复性及浓度测定

2.3.7 弗氏柠檬酸杆菌兔高免血清制备

2.3.8表达产物的Western Blotting鉴定

2.4 讨论

第3章 羊源弗氏柠檬酸杆菌Ⅰ型菌毛FimA和FimH蛋白的免疫原性分析

3.1 实验材料

3.1.1 菌株、血清和蛋白

3.1.2 实验动物

3.1.3 主要仪器设备

3.1.4 实验试剂和主要溶液的配置

3.2 实验方法

3.2.1 弗氏佐剂疫苗的制备

3.2.2 小鼠LD50测定

3.2.3 小鼠免疫保护试验

3.2.4 免疫小鼠血清中IgG水平检测

3.2.5 弗氏柠檬酸杆菌小尾寒羊感染模型的建立

3.2.6Montanide TM GEL 01 PR（GEL）水溶性佐剂疫苗的制备

3.2.7 小尾寒羊的免疫保护实验

3.3 实验结果

3.3.1 小鼠毒力LD50测定结果

3.3.2 免疫小鼠血清中IgG水平检测结果

3.3.3 免疫小鼠攻毒保护试验结果

3.3.4 小尾寒羊的毒力试验结果

3.3.5 羊的免疫保护试验结果

3.4 讨论

第4章 结论

参考文献

致谢

攻读学位期间的研究成果