抗CD45单克隆抗体的制备及临床应用

摘要

目的：构建人CD45重组蛋白表达载体，转染人肾上皮细胞（HEK293T）细胞表达糖基化的重组蛋白。尝试 HEK293T细胞表达的糖基化蛋白作为抗原，筛选高特异性和亲和力的抗体，并验证其在循环肿瘤细胞检测上的适用性。
　　方法：以人 CD45胞外段基因构建真核表达载体，在 HEK293T细胞内表达重组人CD45蛋白（rhCD45）。采用镍柱进行亲和纯化CD45重组蛋白，经SDS-PAGE电泳鉴定分子量，采用LC-MS/MS质谱技术进行糖基化分析。以rhCD45蛋白作为抗原免疫小鼠，通过杂交瘤技术获得融合细胞。用ELISA方法、流式细胞术、免疫荧光实验、表面等离子体技术对抗体进行筛选鉴定。选择高亲和力抗体4D3偶联荧光素Alexa647，与商业抗体进行对比，并应用于临床循环肿瘤细胞（CTC）的检测。
　　结果：成功构建了pCDNA3.1-CD45-his重组表达质粒，转染200mLHEK293T细胞，共得到2mg CD45重组蛋白；经SDS-PAGE电泳鉴定，蛋白的纯度在90％以上。LC-MS/MS二级质谱分析CD45重组蛋白糖基化位点：8个O-型糖基化位点和4个N-型糖基化位点，共12个糖基化位点；每个位点连接不同的糖链；糖基化蛋白作为抗原制备单克隆抗体，ELISA阳性率6.72%；流式细胞术阳性率1.8%；4株抗体结合CD45天然蛋白，克隆号分别为1G11，4D3，4E3，4E11。表面等离子体共振（SPR）分析抗体的亲和力，其中4D3抗体亲和力达10-12；灵敏度检测值达到60ng/mL。荧光素Alexa647偶联4D3抗体，亲和力高于进口商业抗体，可识别淋巴细胞（T细胞、B细胞、NK细胞）和外周血中循环肿瘤细胞。
　　结论：用 HEK293T细胞成功表达并纯化天然糖基化的CD45蛋白，以此为抗原成功筛选高亲和力的单克隆抗体，经临床检测，外周血白细胞阳性率优于商业抗体，符合临床及科研需求。

目录

声明

第1章 绪论

1.1 单克隆抗体的研究进展

1.2 单克隆抗体制备技术的研究进展

1.3存在问题及展望

第2章 引言

第3章 材料与方法

3.1 材料

3.2 方法

3.3CD45单克隆抗体的鉴定及初步应用

3.4抗CD45单克隆抗体的临床应用

第4章 结果

4.1 CD45-his重组质粒的构建

4.2 CD45-his蛋白表达与纯化

4.3 杂交瘤细胞的制备与筛选

4.5抗体的标记与临床应用

第5章 讨论

5.1 重组蛋白的表达

5.2 筛选杂交瘤抗体的方法

第6章 结论

参考文献

缩略语词汇表

附录

致谢

攻读学位期间的研究成果