副猪嗜血杆菌LAMP快速检测方法的建立

摘要

副猪嗜血杆菌（Haemophlius parasuis，Hps）危害严重，是目前养猪业的多发病之一，建立快速准确的诊断方法，及时采取相应的防治措施是防治成功的关键。但是副猪嗜血杆菌分离难度较大，常规的检测方法比较繁琐，且需要昂贵的仪器设备，很难在基层推广。而环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification, LAMP）简单方便，不需要特殊设备，所以建立基于LAMP的副猪嗜血杆菌的快速检测方法十分必要，在临床检测中的应用潜力非常大。
　　本研究通过比对GengBank中已发表的Hps16S rRNA序列，找出其高度保守区域，以此为靶基因并针对其6个特异性区域设计出4条特异性引物：两条外引物 F3、B3和两条内引物 FIP、BIP，利用 Bst DNA聚合酶的链置换作用对Hps进行 LAMP扩增反应，通过优化反应体系和反应条件建立了 Hps的LAMP快速检测方法，并检测该方法的灵敏性与特异性。
　　1.最佳反应体系的筛选
　　通过设置单因素梯度变化分别对反应体系中的内外引物比（ F3∶FIP， B3∶BIP）、Mg2+终浓度、dNTPs终浓度进行优化，内引物比梯度为1∶1、1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10，Mg2+终浓度梯度为0 mM、2 mM、4 mM、6 mM、8 mM、10 mM，dNTPs终浓度梯度为0 mM、1 mM、2 mM、3 mM、4 mM、5 mM。最终确立了LAMP反应的最佳反应体系：外引物各0.2μM，内引物各0.8μM，Mg2+终浓度为6 mM，dNTPs终浓度为3 mM，10×ThermoPol缓冲液2.5μL，Bst DNA聚合酶1μL，模板1μL，补水至25μL。
　　2.最佳反应条件的优化
　　通过设置单因素梯度变化分别对反应温度和反应时间进行优化，反应温度梯度为60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃，反时间梯度为30 min、40 min、50 min、60 min、70 min。结果显示反应在63℃条件下1 h即可完成。
　　3. LAMP灵敏性检测
　　对Hps基因组DNA进行10-n倍梯度稀释，以100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8倍稀释的基因组为模板分别进行常规 PCR反应和 LAMP反应，通过比较两种反应的检测结果来反映 LAMP反应的敏感性。结果显示LAMP方法敏感性是PCR的100倍，最低检出量为0.241 pg/μL。
　　4. LAMP特异性检测
　　分别以副猪嗜血杆菌、猪链球菌（ Streptococcus suis）、沙门氏菌（ Salmonella enteriditis）、大肠杆菌（ Escherichia coli）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae）、金黄色葡萄球菌（Staphylocococcus aureus）为模板，用本研究所建立的方法进行LAMP反应，验证该方法的特异性。结果表明该方法仅副猪嗜血杆菌能扩增出条带，其他细菌均不能，说明该方法具有较好的特异性。
　　本研究成功的建立了副猪嗜血杆菌 LAMP快速检测方法，该方法操作简便、灵敏度高、特异型强，能够用肉眼直观的观察实验结果，适用于基层和现场快速诊断，为副猪嗜血杆菌的临床诊断提供了重要的理论依据。

目录

声明

符号表

第1章 文献综述部分

1.1 立题的背景和意义

1.2 副猪嗜血杆菌及副猪嗜血杆菌病

1.2.1 副猪嗜血杆菌的生物学性状

1.2.2 副猪嗜血杆菌的流行病学

1.2.3 副猪嗜血杆菌的致病机理

1.2.4 副猪嗜血杆菌的毒力因子

1.2.5 副猪嗜血杆菌病的临床表现和病理变化

1.3 副猪嗜血杆菌检测方法研究现状

1.3.1 细菌分离鉴定

1.3.2 免疫组织化学法检测

1.3.3 间接凝集试验（IHA）

1.3.4 酶联免疫吸附试验（ELISA）

1.3.5 分子生物学检测方法

1.4 环介导等温扩增技术

1.4.1 环介导等温扩增技术概述

1.4.2 LAMP特点

1.4.3 LAMP引物设计

1.4.4 LAMP技术的基本原理

1.4.5 LAMP技术在细菌检测中的应用

第2章 实验研究部分

2.1 材料

2.1.1 菌株

2.1.2 培养基

2.1.3 主要试剂

2.1.4 仪器和设备

2.2 方法

2.2.1 菌株的活化与纯化

2.2.2 革兰氏染色镜检

2.2.3 副猪嗜血杆菌基因组DNA的提取

2.2.4 引物设计

2.2.5 PCR扩增

2.2.6 LAMP反应初始体系与程序

2.2.7 LAMP反应体系的优化

2.2.8 LAMP反应条件的优化

2.2.9 LAMP反应可视化检测分析

2.2.10 LAMP方法敏感性检测

2.2.11 LAMP方法特异性检测

2.2.12 LAMP检测方法的临床初步实践

2.3 结果与分析

2.3.1 革兰氏染色镜检结果

2.3.2 LAMP反应体系优化结果

2.3.3 LAMP反应条件优化结果

2.3.4 LAMP反应可视化检测结果

2.3.5 LAMP方法敏感性检测结果

2.3.6 LAMP方法特异性检测结果

2.3.7 LAMP方法临床初步实践结果

2.4 讨论

2.4.1 本研究的意义和价值

2.4.2 LAMP体系中各条件的影响

2.4.3 LAMP操作中的假阳性问题

2.4.4 LAMP操作中的其他问题

2.4.5 进一步研究与改进

第3章 结论

参考文献

致谢

攻读学位期间的研究成果