三种致奶牛流产病原多重巢式PCR检测方法的建立与应用

摘要

近些年来，养殖奶牛流产率居高不下，某些地区奶牛的流产率甚至可以达到20％以上，给养殖户来带难以忽视的经济损失。因此，快速并准确的检测出引起奶牛流产的原因，对预防和控制奶牛流产具有相当重要的意义。
　　通过随机调查走访后，发现周口地区各个奶牛养殖场（饲养小区）部分奶牛流产率高达21%。其中在第2-4胎的母牛流产率明显高于其他胎次，流产率可以达到16.95%~25.53%；母牛流产多发于春秋季，该时间段内流产数量占总流产数的48.76%（236/484）。
　　新孢子虫、布氏杆菌和弓形虫是引起奶牛流产的三种常见病原，为同步检测引起奶牛流产的三种常见病原新孢子虫、布氏杆菌和弓形虫，本研究分别设计针对新孢子虫ITS1基因（Nc-ITS1）、布氏杆菌16S rRNA基因（Ba-16S rRNA）及弓形虫529 bp重复序列基因（Tg-529 bp）的特异性巢式PCR引物，建立并优化了能够同时检测这三种病原的多重巢式 PCR方法。结果显示，多重巢式 PCR对 Nc-ITS1、Ba-16S rRNA及 Tg-529 bp扩增产物的大小分别为601 bp、380 bp、245 bp。外引物退火温度为57℃，内引物为53℃；Taq酶、dNTP和Mg2+浓度分别为1.0 U、2.0 mmol/L和1.0 mmol/L；Ba-16S rRNA、Nc-ITS1和 Tg-529 bp外、内引物浓度均为0.4μmol/L。该多重巢式PCR对Nc-ITS1和Ba-16S rRNA检测敏感性达3×102拷贝/反应，对 Tg-529 bp达3×101拷贝/反应，对住肉孢子虫、大肠杆菌、沙门氏菌、李氏杆菌、金黄色葡萄球菌和链球菌扩增均无目的条带，表明本研究构建优化的多重巢式 PCR检测方法拥有良好的敏感性和特异性。同时使用该方法与单巢式PCR方法对30临床流产样本进行诊断，其诊断结果一致。表明该方法在临床样品检测中拥有较好的应用效果。
　　应用该方法检测周口地区的172份临床样品，结果显示新孢子虫阳性52份，布氏杆菌阳性4份，弓形虫阳性2份，其中新孢子虫和布氏杆菌混合感染1份。结果表明，新孢子虫病是造成周口地区奶牛发生流产的主要原因之一，为进一步防控该地区奶牛流产提供一定参考。

目录

声明

符号表

第1章 文献综述

1.1 前言

1.2 三种引起奶牛流产疾病的概述

1.3 目国内外研究现状及分析

1.4 本研究的目的和意义

第2章 周口地区奶牛流产情况的走访调查

2.1 调查方法

2.2 结果

2.3 讨论

第3章 多重巢式PCR方法的建立与优化

3.1 材料

3.2 方法

3.3 结果

3.4 讨论

第4章 多重巢式PCR方法的临床应用

4.1 材料

4.2 方法

4.3 结果

4.4 讨论

第5章 结论

参考文献

致谢

攻读学位期间的研究成果