IRE1α和IRE1β在小鼠慢性结肠炎和结直肠肿瘤中的表达及意义

摘要

背景：
　　在全世界，每年可确诊100多万例结直肠癌患者，结直肠癌在全球范围内的发病率居第三位，其死亡率居第四位，其中部分患者中可能与遗传因素有关，大多数患者发病与饮食，肠道微生物及肠道炎症等环境因素有关。炎症相关性结直肠癌（colitis-associated cancer,CAC）作为结直肠癌的一个亚型，其主要有炎症性肠病（inflammatory bowel disease,IBD）发展而来，IBD包括克罗恩病（Crohn's disease,CD）和溃疡性结肠炎（ulcerative colitis,UC），在CAC和非炎症相关性结直肠癌的发生发展过程中，都共同经历了由局部腺体异常增生-息肉-腺瘤-癌的演变过程。研究发现内质网应激通路相关蛋白在肿瘤的发病机制中有着非常重要的作用，但内质网应激信号蛋白肌醇需求酶1（inositol requiring enzyme1，IRE1）α和IRE1β在这一过程中的具体机制还不清楚。
　　目的：
　　探究IRE1α和IRE1β在小鼠慢性结肠炎和结直肠肿瘤中的表达及意义。
　　方法：
　　将30只8-10周龄的C57BL/6雌性小鼠随机分为3组，每组10只：对照组：正常饮水；慢性炎症组：于造模第七天开始，先给予1.0％葡聚糖硫酸钠（dextra sulfate sodium，DSS）自由饮用7天，然后正常饮水14天，如此循环三次；肿瘤组：造模第一天腹腔注射氧化偶氮甲烷（azoxymethane，AOM）（12mg/kg），一周后给予1.0%DSS自由饮用7天，然后正常饮水14天，以7天DSS加14天水为一循环，如此循环三次。造模第一天对照组和慢性炎症组均注射生理盐水作为对照。各组小鼠均给予足量饲料。于第十周末，处死小鼠收取标本。通过疾病活动指数评分、结肠长度测定、肿瘤大小、数目和HE染色等方法评估肠道炎症和肿瘤生长情况。通过细胞炎性因子白细胞介素（interleukin,IL）-6、IL-8和肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor, TNF）-α mRNA水平评估肠道炎症程度，采用实时定量PCR技术检测小鼠结肠组织中IRE1α、X-盒结合蛋白1（X-box binding protein1，XBP1）u/s、IRE1β和黏蛋白（Mucin，MUC）2 mRNA表达，免疫组织化学方法检测IRE1α、IRE1β、MUC2表达，Western Blot检测IRE1α和IRE1β的表达。结果用统计软件SPSS20.0进行分析。
　　结果：
　　1.在三个周期末对照组小鼠无肠炎表现，慢性炎症组结肠出现炎症表现，肿瘤组，发现结肠有肿瘤生长。在慢性炎症组和肿瘤组中，DAI评分较对照组均显著增高（均 P＜0.05）；慢性炎症组和肿瘤组的结肠长度均较对照组缩短（均 P＜0.05）。造模最后一天，对照组小鼠结肠内无血便，且大便成形；慢性炎症组结肠内存有稀软便，未见肉眼血便；肿瘤组小鼠以稀便为主，大便不成形，5只小鼠可见肉眼血便，其与对照组和慢性炎症组均由明显差异（P＜0.05）。
　　2.实时定量PCR结果显示，IL-6、IL-8和TNF-α mRNA在肿瘤组和慢性炎症组均明显高于对照组（均P＜0.05）；IL-8和TNF-α mRNA在肿瘤组明显高于慢性炎症组（P＜0.05）；IRE1α mRNA的表达在慢性炎症组与对照组和肿瘤组与对照组之间均没有明显差异；XBP1u mRNA在慢性炎症组中的表达水平明显低于对照组（P＜0.05）,XBP1s mRNA在肿瘤组中的表达水平均明显高于对照组和慢性炎症组（均P＜0.05）；IRE1β mRNA的表达水平在慢性炎症组和肿瘤组中明显低于对照组，在慢性炎症组中的表达量是对照组的31%，肿瘤组是对照组的42%（均P＜0.05）；而且IRE1β mRNA在肿瘤组中的表达量明显高于慢性炎症组（P＜0.05），MUC2 mRNA的表达水平在慢性炎症组和肿瘤组均明显低于对照组，分别是对照组的25%和30%（均 P＜0.05），而在慢性炎症组和肿瘤组之间没有明显差异。
　　3.免疫组化染色及Western Blot结果显示，IRE1α蛋白主要表达于结肠上皮的刷状缘和一些炎症细胞的胞浆中，其表达量在炎症结肠组织中均高于对照组和肿瘤组（均 P＜0.05），IRE1β蛋白和 MUC2蛋白主要表达于结肠上皮杯状细胞胞质中，两者表达量在慢性炎症组和肿瘤组的结肠组织中均低于对照组（均P＜0.05）。Western Blot显示IRE1α和IRE1β的蛋白表达与免疫组化结果一致。
　　结论：
　　1.本实验证实了内质网应激IRE1α-XBP1通路在结直肠肿瘤发生发展过程中被激活，并通过XPB1u/s参与了结直肠肿瘤的发生发展。
　　2.IRE1β和MUC2在维持结肠组织的正常生理功能中可能发挥着重要的作用，可能是结肠发挥正常功能的标志；而IRE1β和MUC2表达的下调可使结肠对周围环境不良因素的抵抗能力下降，从而促进了肿瘤和炎症的发生和发展。

目录

声明

第1章 绪论

1.1 研究背景

1.2 研究目的

1.3 研究意义

第2章 材料与方法

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.3 统计学方法

第3章 实验结果

3.1 一般情况观察

3.2 结肠长度、DAI评分及结肠内血便评分

3.3 大体形态学观察

3.4 组织病理学观察

3.5 结肠组织中IL-6、IL-8、TNF-αmRNA 的表达

3.6 IRE1α、XBP1u 、XBP1s、IRE1β和MUC2的mRNA表达情况

3.7 免疫组化结果显示IRE1α、IRE1β和MUC2蛋白的表达

3.8Western Blot检测IRE1α、IRE1β蛋白的表达

第4章 讨论

4.1 IRE1α和IRE1β在DSS诱导的小鼠慢性结肠炎中的表达及意义

4.2 IRE1α和IRE1β在小鼠结肠肿瘤中的表达及意义

4.3 IRE1α和IRE1β在肿瘤组和慢性炎症组中的表达及意义

第5章 结论

参考文献

缩略语词汇表

致谢

攻读学位期间的研究成果