鼠伤寒沙门菌ΔsodA缺失株的构建及其对巨噬细胞自噬的影响

摘要

鼠伤寒沙门菌作为病原菌，在入侵宿主体内之后会遭遇到宿主出于免疫保护而形成的高活性氧（ROS）内环境。过量的ROS会对生物体的DNA、蛋白质和脂类等产生毒害作用。超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)作为唯一可以清除超氧阴离子（?O2-）的抗氧化酶系成员，是细胞抵御ROS胁迫的第一道防线。已有研究表明，SOD参与到细菌的生长、菌膜生成、毒力等方面，但是对于其在鼠伤寒沙门菌中的功能研究，迄今为止还未见报道。因此本实验通过Red重组系统，构建了鼠伤寒沙门菌SM52ΔsodA缺失株和SM52CΔsodA互补株，对其生物学特性以及对巨噬细胞自噬的影响进行探讨，并且表达了SodA蛋白，对其酶学性质进行研究。为进一步研究sodA基因的功能以及在细胞自噬过程中的作用奠定良好基础。主要内容如下：
　　1.鼠伤寒沙门菌ΔsodA缺失株的构建及生物学特性研究
　　利用Red同源重组系统构建鼠伤寒沙门菌sodA基因缺失株SM52ΔsodA以及互补株SM52CΔsodA，并对其生长速度、抗氧化胁迫、运动性、菌膜形成、耐环境压力（酸、碱、渗透压、血清）、ROS测定、酶活性等生物学特性进行研究。结果显示， SM52ΔsodA以及SM52CΔsodA构建成功。SM52ΔsodA缺失株在生长速度、抗氧胁迫、SOD酶活性、菌膜形成、耐血清方面相较于SM52、SM52CΔsodA下降明显；SM52ΔsodA在流动性、耐酸、耐碱、耐高渗透压方面无变化； SM52ΔsodA胞内外ROS含量显著高于SM52与SM52CΔsodA。
　　2.鼠伤寒沙门菌超氧化物歧化酶sodA基因的表达及酶学性质研究
　　利用原核表达系统构建了pET-28a-sodA表达载体，经SDS-PAGE电泳鉴定实现了高效表达。过镍柱将SodA蛋白纯化之后对其酶学性质进行研究。结果显示SodA蛋白分别在40℃、乙醇体积分数为0、PH=7.0时到达最大活性，随着条件的变化，活性逐次降；其热稳定性较一般，80℃保温1h，活性仅剩21％；抑制剂实验中，SodA蛋白对SDS、氯仿-乙醇敏感，对H2O2不敏感；Mn2+、Zn2+、Cu2+对SodA蛋白活性促进效果最明显， Fe3+抑制效果最明显， Mg2+、Ca2+、Ba2+、Na+、K+对蛋白活性无影响；SodA蛋白催化邻苯三酚的Vmax为2.03 U/min，Km为0.801 mmol/L。
　　3.鼠伤寒沙门菌sodA基因对巨噬细胞自噬的影响
　　将SM52、SM52ΔsodA、SM52CΔsodA感染鼠巨噬细胞RAW264.7后，应用荧光共聚焦观察 LC3-Ⅱ变化；以及蛋白免疫印迹(Western blot，WB)法检测不同时间点自噬相关蛋白 LC3-Ⅱ、Beclin-1、p62含量的变化；观察不同时间点胞内活菌数量变化。荧光共聚焦结果显示，在细胞与细菌共培养1 h后， SM52ΔsodA感染组胞内 LC3-Ⅱ的点状聚集数量明显高于 SM52、SM52CΔsodA组（P＜0.05）；WB结果显示，在细胞与细菌共培养1 h后，SM52ΔsodA感染组的LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白表达量都比 SM52、SM52CΔsodA组明显上升（P＜0.05），p62蛋白表达量下调明显，共培养2 h和3 h之后没有明显变化。活菌计数 CFU结果显示，在共培养1 h之后，三组活菌数量无明显差异，随着时间延长到2 h和3 h后，SM52、SM52CΔsodA感染组胞内活菌数明显高于SM52ΔsodA感染组（P＜0.05）。以上结果显示 sodA对发生在细菌细胞共作用早期的自噬有抑制作用，利于携带sodA基因的宿主菌在细胞内的存活。

目录

声明

符号表

第1章 文献综述

1.1 沙门菌研究进展

1.2 超氧化物歧化酶研究现状

第2章 沙门菌sodA缺失株的构建及生物学特性研究

2.1 材料

2.2 方法

2.3 结果

2.4 讨论

第3章 鼠伤寒沙门菌超氧化物歧化酶SodA基因的表达及酶学性质研究

3.1 材料

3.2 方法

3.3 结果

3.4 讨论

第4章 鼠伤寒沙门菌sodA基因对巨噬细胞自噬的影响

4.1 材料

4.2 方法

4.3 结果

4.4 讨论

第5章 结论

参考文献

致谢

硕士期间的研究成果