芝麻隐性核不育基因(ms)的精细定位及候选基因分析

摘要

芝麻因含油量高、营养丰富，在我国占有着重要的地位。芝麻的品质和产量在农业生产中备受瞩目。杂种优势的利用，是提升芝麻产量、品质和抗性的关键因素。雄性不育是芝麻杂种优势利用的最有效途径，但目前为止，关于芝麻雄性不育机理的相关研究报道较少。
　　本研究利用芝麻隐性核不育系ms86-1与豫芝11号构建F2群体，结合简化基因组测序（SLAF-seq）和BSA法，进行基因定位和候选基因预测，得到如下结论：
　　（1）利用 Super-BSA的方法，将 ms基因初步定位在 LG1:17,441,550-19,489,858（2.05 M）区域内。在2.05 M的区间内设计66对SNP、SSR引物，筛选出了多态性引物9对，并在构建的F2群体中完成验证，构建了局部遗传图谱，将目的基因ms定位在G03-04与G03-27标记之间。ms基因距离标记G03-04和G03-27的遗传距离，分别为0.8 cM和4.2 cM，两个标记间的物理距离约882 kb。为了进一步缩小ms基因的定位区间，用亲本进行基因组重测序，开发功能标记，进一步筛选出8对SNP、InDel多态性引物。最终ms雄性不育基因被定位在了G03-03、G03-70标记之间， ms基因距离两标记的遗传距离，分别为0.7 cM和0.1 cM，两个标记间的物理距离约30 kb。
　　（2）利用 NCBI的Blast比对，发现该区域有5个功能注释的基因：E3 ubiquitin-protein ligase SINAT5-like（ LOC105173705）、UV-stimulated scaffold protein A homolog（ LOC105173714）、protein aspartic protease in guard cell2（ LOC105173723）、serine/threonine-protein phosphatase7 long form homolog（ LOC105159028） and Cicer arietinum cytochrome P45071A1-like（LOC101514759）。
　　（3）利用荧光定量对LOC101514759、LOC105173723两个功能基因在花粉发育的7个时期进行分析，结果表明：LOC101514759基因（功能注释为细胞色素P450），在不育和可育的花粉形成过程，定量表达趋势基本相同。基因LOC105173723（功能注释为天冬氨酸蛋白酶），在可育花粉形成过程中表达量呈现逐渐上升趋势。但在不育花粉的形成期，则呈现双峰趋势（即先升高后降低再升高后降低）。在小孢子中期，不育花粉中基因LOC105173723的表达量达到最大值。在单核小孢子中期，该基因在可育和不育花粉中的表达量差异最为明显，不育花粉中基因LOC105173723的表达量远远大于可育花粉，约为可育花粉的二倍。荧光定量PCR结果表明，在小孢子早期、小孢子中期和花粉成熟期，基因LOC105173723在不育和可育花粉中的表达量均呈现差异显著。
　　本文获得的与ms基因关联的分子标记及候选基因，也为芝麻的分子育种及ms候选基因的克隆提供参考。

目录

声明

第1章 文献综述

1.1 植物雄性不育的研究

1.1.1 植物雄性不育的分类

1.1.2 植物雄性不育的细胞形态学研究

1.2 植物雄性不育的分子标记研究

1.2.1 InDel标记

1.2.2 SNP标记

1.2.3 SSR标记

1.2.4 其他标记

1.3 基因定位的研究

1.3.1 遗传图谱的研究

1.3.2 QTL定位的研究

1.3.3 基因定位的方法

1.4 研究目的及意义

第2章 材料与方法

2.1 试验材料和表型鉴定

2.2 试验方法

2.2.1 DNA的提取与检测

2.2.2 SLAF测序与BSA分析

2.2.3 InDel、SSR及SNP标记的开发及引物设计

2.2.4 PCR产物的检测

2.2.5 遗传图谱的构建

2.2.6 差异表达分析

第3章 结果与分析

3.1 ms基因的Super BSA关联分析

3.1.1 测序数据统计与评估

3.1.2 SLAF标签的开发

3.1.3 SLAF标签多态性的分析及筛选

3.1.4 SNP的检测

3.1.5 SNP-index关联分析结果

3.1.6 ms基因关联区域的注释基因

3.2 ms基因的精细定位

3.2.1 引物设计及多态性引物筛选

3.2.2 多态性引物的验证

3.2.3 构建局部遗传连锁图谱

3.2.4 进一步定位

3.2.5 构建局部遗传连锁图谱

3.3 功能基因的预测

3.4 候选基因的差异表达

3.4.1 RNA提取质量检测

3.4.2 荧光定量PCR验证

3.4.3 基因LOC101514759、LOC105173723的功能分析

第4章 讨论、结论与展望

4.1 讨论

4.1.1 Super BSA的利用

4.1.2 不育基因的定位及分子标记的开发

4.1.3 氨基酸及相关酶类对于植株育性的影响

4.2 结论

4.3 展望

参考文献

致谢