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第1章 文献综述
1.1 鼠伤寒沙门菌的研究进展
1.1.1 生长特征
1.1.2 抵抗力
1.1.3 流行病学特征
1.1.4 致病机制
1.2 鞭毛的结构研究
1.2.1 鞭毛的基本结构
1.2.2 鞭毛蛋白
1.3 鞭毛的基本功能
1.3.1 鞭毛蛋白与黏附、侵袭的相关性
1.3.2 鞭毛蛋白与天然免疫应答
1.3.3 鞭毛蛋白对体液免疫的影响
1.3.4 鞭毛蛋白对细胞免疫的影响
1.3.5 鞭毛蛋白对粘膜免疫的影响
1.3.6 鞭毛蛋白作为免疫佐剂的研究
1.3.7 鞭毛与细菌分泌系统的相关性
1.3.8 鞭毛蛋白与巨噬细胞
1.3.9 鞭毛与生物被膜
1.4 研究目的与意义
第2章 鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白FliC基因的克隆及生物信息学分析
2.1 材料
2.1.1 菌株、质粒
2.1.2 主要试剂和培养基
2.1.3 主要试剂和培养基的配制
2.1.4 主要仪器
2.2 方法
2.2.1 引物的合成
2.2.2 质粒DNA的提取
2.2.3 PCR产物回收
2.2.4 大肠杆菌感受态(DH5α及Rosetta)的制备
2.2.5 FliC目的基因的扩增
2.2.6 重组载体pMD18-T-FliC的连接
2.2.7 感受细胞的转化
2.2.8 重组载体pMD18-T-FliC的PCR及酶切鉴定
2.2.9 同源性分析
2.2.10 氨基酸序列分析
2.2.11 二级结构分析及三级结构模型构建
2.2.12 理化性质分析
2.2.13 结构分析
2.3 结果与分析
2.3.1 重组载体pMD18-T-FliC的PCR鉴定与酶切鉴定
2.3.2 FliC基因的测序与分析
2.3.3 鞭毛FliC基因序列同源性分析
2.3.4 氨基酸序列分析
2.3.5 二级结构分析及三级结构模型构建
2.3.6 理化性质分析
2.3.7 结构分析
2.4 讨论
2.5 结论
第3章 鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白FliC基因原核表达系统的构建及特性研究
3.1 材料
3.1.1 菌株、质粒、小鼠和细胞
3.1.2 主要试剂和培养基
3.1.3 主要试剂和培养基的配制
3.1.4 主要仪器
3.2 方法
3.2.1 重组表达载体pET-32a-FliC的构建及鉴定
3.2.2 重组蛋白体外的表达及鉴定
3.2.3 His-标记的蛋白柱纯化蛋白
3.2.4 细胞的复苏、传代与冻存
3.2.5 CCK-8法检测巨噬细胞增殖情况
3.2.6 重组鞭毛蛋白诱导细胞因子表达情况
3.2.7 ELISA法测定免疫小鼠血清细胞因子含量
3.3 结果与分析
3.3.1 重组表达载体pET-32a-FliC鉴定
3.3.2 重组蛋白体外的表达及鉴定
3.3.3 CCK-8法检测巨噬细胞增殖情况
3.3.4 重组鞭毛蛋白诱导巨噬细胞因子表达情况
3.3.5 重组鞭毛蛋白诱导小鼠细胞因子表达情况
3.4 讨论
3.5 小结
第4章 鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白FliC基因缺失菌株的构建及生物学特性研究
4.1 材料
4.1.1 菌株和质粒
4.1.2 主要试剂和培养基
4.1.3 主要试剂和培养基的配制
4.1.4 主要实验仪器
4.2 方法
4.2.1 引物的设计合成
4.2.2 细菌的活化及培养条件
4.2.3 鼠伤寒沙门菌SL1344株FliC基因上下臂片段的扩增
4.2.4 PCR融合FliC基因上下臂片段
4.2.5 重组载体pMD18-T-? FliC的构建及鉴定
4.2.6 重组自杀性质粒pRE-? FliC的构建与鉴定
4.2.7 缺失菌株SL1344? FliC的筛选
4.2.8 缺失菌株SL1344? FliC的遗传稳定性
4.2.9 缺失菌株SL1344? FliC的生长特性
4.2.10 缺失菌株SL1344? FliC的运动性
4.2.11 鞭毛缺失菌株与生物被膜分析
4.2.12 鞭毛缺失菌株SL1344? FliC的毒力测定
4.2.13 鞭毛缺失菌株SL1344? FliC的侵袭力测定
4.3 结果与分析
4.3.1 鼠伤寒沙门菌SL1344株FliC基因上下臂片段的扩增及融合
4.3.2 重组载体pMD18-T-? FliC 的酶切鉴定
4.3.3 质粒pRE-? FliC的鉴定
4.3.4 缺失菌株SL1344? FliC的筛选
4.3.5 缺失菌株SL1344? FliC的遗传稳定性
4.3.6 缺失菌株SL1344? FliC的生长特性
4.3.7 缺失菌株SL1344? FliC的运动性
4.3.8 鞭毛缺失菌株的生物被膜定量分析
4.3.9 鞭毛缺失菌株SL1344? FliC的毒力测定
4.3.10 鞭毛缺失菌株SL1344? FliC的侵袭力测定
4.4 讨论
4.5 小结
第5章 表达鞭毛蛋白FliC基因的重组鼠伤寒沙门菌的构建与鉴定
5.1 材料
5.1.1 菌株和主要试剂
5.1.2 主要仪器
5.1.3 主要培养基及配制
5.2 方法
5.2.1 引物的设计与合成
5.2.2 重组质粒pMD18-T-FliC的构建及鉴定
5.2.3 沙门菌SL1344感受态的制备
5.2.4 沙门菌的电转化
5.2.5 重组菌株的酶切鉴定
5.2.6 缺失互补菌株的构建
5.2.7 高效重组菌的表达鉴定
5.3 结果
5.3.1 重组质粒pMD18-T-FliC的酶切结果
5.3.2 重组质粒pBR322-FliC的酶切及测序
5.3.3 Western-blot鉴定
5.4 讨论
5.5 小结
第6章 结论
参考文献
附录A主要仪器设备
致 谢
硕士期间的研究成果
