茯苓多糖深层发酵、提取的参数控制及羧甲基化改性研究

摘要

茯苓是一味珍贵的药食两用菌，也是传统的中药材；茯苓多糖具有增强免疫、防治肿瘤等生物活性，而且许多新的生物学作用也在不断发现和利用。目前，茯苓多糖主要通过野生或人工种植获得，周期长、成本高；而深层发酵法生产茯苓多糖则具有周期短、成本低等优点。采用液体发酵及分离提取等新技术，已成为茯苓多糖等活性物质工业化生产的新方向。
　　 本文以茯苓菌株HD08-10为研究材料，通过深层发酵，优化其发酵参数并确定其最适的发酵培养基；对茯苓发酵菌丝体多糖提取分离，对其提取工艺参数进行优化；以获得的多糖为原料合成羧甲基茯苓多糖(Carboxymethylpachymaran，CMP)，并优化其制备工艺；通过多步纯化、组分分析、理化结构性质鉴定等方法和手段研究CMP，并分析多种因素对CMP黏度的影响，为扩大茯苓多糖及其衍生物的应用范围奠定理论基础。主要研究结果有：
　　 以菌体生物量和多糖产量为指标，对碳氮源种类及比例、pH值、培养温度、摇瓶转速、装液量以及接种量等参数进行参数控制研究：并通过正交试验设计，最终确定了发酵培养基配方及发酵过程参数为：葡萄糖4％、蛋白胨0.75％、硝酸钾0.75％、硫酸镁0.05％、磷酸二氢钾0.1％、pH5.5、温度26℃、转速150r/m、装液量80mL、接种量6％。
　　 采用响应面分析法对茯苓发酵菌丝体多糖的提取参数进行了优化，并确定最佳工艺参数为：提取时间4.3h，提取温度73.8℃，水料比29.8∶1。此条件下茯苓多糖理论提取率达到2.45％，验证试验多糖提取率可达2.57％，模型与试验拟合较好，自变量与响应值间的线性关系显著。因此，采用响应面法优化得到的参数准确可靠，具有实用价值。
　　 采用正交试验法对CMP的制备工艺优化，并确定最佳条件为：温度50℃，NaOH1％，氯乙酸7g；对CMP进行多步纯化、组分分析和理化结构性质鉴定，表明仅由羧甲基葡萄糖组成，糖环为吡喃型，糖苷键以β-1→3)连接为主，分子量约为4.2×104Da；对黏度特性进行研究，发现浓度、温度、pH值以及无机盐等因素与CMP的黏度有很大相关性。

目录

文摘

英文文摘

声明

1前言

1.1茯苓概述

1.1.1茯苓的主要成分

1.1.2茯苓的形态特征及培养方法

1.1.3茯苓多糖及其衍生物的药理学研究

1.2真菌多糖的研究

1.2.1真菌多糖的提取分离、纯化及分子量测定

1.2.2真菌多糖的结构分析

1.2.3真菌多糖的功能活性研究

1.2.4真菌多糖构效关系的研究

1.2.5真菌多糖分子修饰的研究

1.3多糖的羧甲基化研究

1.3.1羧甲基多糖衍生物的制备

1.3.2羧甲基多糖的分析鉴定及生物活性研究

1.4本课题研究的背景和主要内容

2材料与方法

2.1材料

2.1.1菌株

2.1.2培养基

2.1.3主要试剂

2.1.4主要仪器设备

2.2方法

2.2.1茯苓培养方法及生长研究

2.2.2茯苓深层发酵代谢曲线的研究

2.2.3茯苓发酵多糖的提取流程及多糖提取率的测定

2.2.4羧甲基茯苓多糖的制备

2.2.5羧甲基茯苓多糖的纯化

2.2.6分析检测方法

2.3试验设计

2.3.1茯苓发酵过程的参数控制优化

2.3.2正交试验设计法优化茯苓发酵培养基

2.3.3茯苓菌丝体多糖热水浸提单因素影响试验

2.3.4响应面法优化菌丝体多糖提取工艺参数试验

2.3.5正交试验设计法优化CMP的制备条件

2.3.6 CMP黏度特性的研究

3结果与讨论

3.1茯苓深层发酵过程的研究

3.2茯苓深层发酵的研究

3.2.1茯苓深层发酵过程参数的研究

3.2.2正交试验法优化茯苓发酵培养基

3.2.3讨论

3.3茯苓多糖热水浸提法提取工艺参数控制的研究

3.3.1热水浸提法的单因素试验

3.3.2响应面法优化热水浸提工艺参数

3.3.3讨论

3.4羧甲基化工艺条件的优化

3.4.1正交试验法优化CMP制备条件

3.4.2讨论

3.5 CMP的纯化及纯度鉴定的结果及分析

3.5.1 CMP纯化的结果与分析

3.5.2 CMP纯度鉴定的结果与分析

3.5.3讨论

3.6 CMP理化性质的鉴定及结构表征的结果与分析

3.6.1 CMP一般理化性质的鉴定

3.6.3薄层层析法测定CMP组分

3.6.4 CMP的红外光谱分析

3.6.5讨论

3.7 CMP黏度特性研究的结果与分析

3.7.1 CMP与茯苓多糖的结构对比及对黏度的影响

3.7.2浓度对CMP黏度的影响

3.7.3温度对CMP黏度的影响

3.7.4 pH值对CMP黏度的影响

3.7.5无机盐对CMP黏度的影响

3.7.6讨论

4结论

5展望

参考文献

致谢