血液超氧化物歧化酶提纯工艺改进及其抗氧化活性研究

摘要

超氧化物歧化酶英文简称SOD，是广泛存在于生物体内的一种重要酶，可催化超氧阴离子(O2-)与H+发生歧化反应，生成H2O2和H2O并且可以使自由基的形成和清除处于动态平衡，从而抵御O2-的毒害作用，因而能清除机体内生化代谢所产生的有害物质超氧自由基，具有抗氧化、抗炎症、抗辐射、抗肿瘤和抗衰老等功能。自1969年McCord首次从牛红细胞中分离出SOD以来，人们相继从牛、猪、羊、马等动物红细胞、肌肉、肝脏组织以及植物中分离和纯化出SOD。
　　 SOD根据其金属辅助基的不同，可分为Mn-SOD、Fe-SOD、CuZn-SOD三种类型，Mn-SOD呈紫红色，存在于真核细胞的线粒体和原核细胞中，相对分子量为40000，当线粒体中的核酸DNA受到氧自由基的攻击后，产生8-羟基去氧鸟嘌呤核苷酸，该产物是导致衰老的主要原因，而Mn-SOD具有阻止其损伤作用，Fe-SOD呈黄褐色，存在于原核细胞和植物中，相对分子量38700。在动物血细胞中存在的为Cu Zn-SOD，呈浅兰色，相对分子量在32000左右，Cu Zn-SOD的三维结构由2AX射线晶体结构分析得到，每个酶分子由两个亚基通过非共价健的疏水相互作用缔合成二聚体，肽链内部由半胱氨酸C55和C144的巯基(-SH)构成的二硫桥对亚基缔合起重要作用，Richardso测定了其活性中心，指出由两个亚基组成的SOD活性部位正好是以Cu2+为中心，试验证明Cu2+是CuZn-SOD的活性中心，Zn2+与酶的稳定性有关。
　　 在现有的SOD纯化过程中，粗分级工艺是不可避免的环节，其中必须使用大量的有机溶剂(如乙醇，氯仿等)或无机盐(如硫酸铵，磷酸盐等)，通过有机溶剂和无机盐的分级沉淀去除大部分杂蛋白，获得粗品SOD。然后才能使用后续工艺，如丙酮沉淀、超滤浓缩、透析、柱层析等，进行深入提纯。首先，使用分级沉淀法提取目标蛋白后，废弃液中常常含有高浓度的有机溶剂或无机盐，这些有毒/有害物质的回收非常困难，而一旦排放又会对环保造成巨大压力；其次，有机溶剂和无机盐分级沉淀法操作周期长，提取液经常要在低温下静置过夜；另外，为了促使蛋白质沉淀，有机溶剂和无机盐的使用量通常都很大，抬高了产品的成本。因此，经济、高效、环保的蛋白质纯化技术一直是蛋白质提纯领域的瓶颈环节[9]。目前SOD的提取/生产工艺中，依然沿用传统的分级沉淀技术，这使得SOD生化产品的成本和产量一直难以达到理想水平。
　　 本文就SOD从动物血液中提取工艺进行研究，首次利用低分子量聚丙烯酸钠和氯化铜作为高效分散剂和激活剂来提纯SOD，经过溶血，热变，丙酮沉淀，超滤浓缩等获得SOD粗品，并使SOD粗品酶活性达到传统工艺提取分离的效果，该工艺大大简化了传统工艺，缩短了生产周期，另外层析是获得SOD精品的重要一步，对SOD酶活力有很大提高，在采用沉淀分级后常采用层析方法纯化SOD粗酶液，目前国内外主要集中于凝胶过滤和离子交换层析方面，或者两者的多步组合联用，本文用改进工艺提取SOD后，分别利用SephadexG-75凝胶过滤层析和DEAE-sepharose-fast flow离子交换层析纯化超滤后酶液，两种纯化方法都很容易达到电泳纯。该工艺大大简化了传统工艺，对工业上放大生产有一定的参考价值。

目录

文摘

英文文摘

声明

前 言

第一章SOD的研究概况

1.1 SOD的来源，分类，及其结构和性质

1.1.1 SOD的来源及分类

1.1.2 SOD的种类，结构和性质

1.2 SOD的药理作用

1.2.1 SOD的抗肿瘤作用

1.2.2 SOD的免疫调节作用

1.2.3 SOD对心血管疾病的作用

1.2.4 SOD的抗炎作用

1.2.5 SOD对辐射损伤的防护作用

1.2.6 SOD治疗某些肺部疾病及眼部疾病

1.2.7 SOD治疗某些皮肤病

1.2.8 SOD其他药理作用

1.3 目前国内外SOD应用技术现状和动态

1.3.1 SOD国外提取分离纯化工艺动向

1.3.2 SOD国内提取分离纯化工艺动向

1.3.3 国内利用动物血液提纯SOD具有的优势

1.3.4课题研究的意义

第二章血液SOD传统工艺提取分离改进研究

2.1 传统工艺提取分离SOD

2.1.1仪器和材料

2.1.2方法

2.1.3 结果

2.2血液SOD传统提纯工艺改进的研究

2.2.1仪器和材料

2.2.2方法

2.2.3结果

2.3本章小结

第三章血液SOD提纯工艺改进相关条件的优化

3.1仪器和材料

3.1.1仪器

3.1.2材料

3.2方法

3.2.1 PAAS用量对酶活性影响实验

3.2.2 PAAS溶液pH值对酶活性影响实验

3.2.3氯化铜用量对酶活性影响实验

3.2.4 PAAS分子量对酶活性影响实验

3.2.5热变温度对酶活性的影响实验

3.2.6热变时间对酶活性的影响实验

3.2.7溶血方法对酶活性影响实验

3.2.8热变方式对酶活性影响实验

3.3结果

3.3.1 PAAS用量对SOD提取活性的影响

3.3.2 PAAS溶液pH值对酶活性的影响

3.3.3氯化铜用量对酶活性的影响

3.3.4 PAAS分子量对SOD提取活性的影响

3.3.5热变温度对酶活性的影响

3.3.6热变时间对酶活性的影响

3.3.7溶血方法和热变方式对酶活性的影响

3.3.8最佳提取条件的验证

3.4本章小结

第四章SOD纯化实验和酶相关特性研究

4.1仪器和材料

4.1.1仪器

4.1.2材料

4.2方法

4.2.1凝胶过滤层析纯化

4.2.2离子交换层析纯化

4.2.3 SOD SDS-PAGE电泳

4.2.4酶种类鉴定实验

4.2.5 SOD抗氧化活性研究

4.3结果

4.3.1 SOD凝胶过滤纯化层析谱图

4.3.2 SOD离子交换层析纯化图

4.3.3 SOD活性结果

4.3.4 SOD SDS-PAGE电泳图

4.3.5酶的紫外吸收图谱

4.3.6 1.5％H2O2对酶活力的抑制

4.3.7 KCN对酶活力的抑制

4.3.8 SOD的抗氧化活性

4.4本章小结

全文结论

硕士期间已发表及待发表的论文

附录 蛋白质和PAA形成复合物示意图

参考文献

致 谢