替米沙坦联合冬虫夏草对糖尿病肾病大鼠肾小管上皮细胞转分化的调节作用

摘要

近年来，随着糖尿病患者族群的不断扩大，糖尿病目前已经成为了一个全球关注的健康问题。作为糖尿病比较常见的微血管并发症，糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)的基本病理改变为细胞外基质(extra-cellular matrix，ECM)重构，引起肾小球硬化和肾间质纤维化。在肾间质纤维化的过程中，肾小管上皮细胞间充质转分化(Epithelial-mesenchymal-transition，EMT)起到关键的作用。α平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)的生成是EMI’过程中关键的一步，提示着EMT发生的程度。转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)在体外是最有效的引起EMT的因子，骨成形蛋白-7(bone morphogenic protein-7，BMP-7)属于TGF-β超家族，一般来说主要表达于肾小管的上皮细胞已经以及部分足细胞。有研究显示，当肾小管的上皮细胞受到损伤时，肾组织中的BMP-7表达明显减少。而当对组织进行外源性的补充BMP-7后，肾功能明显得到改善，提示BMP-7可能为逆转肾间质纤维化的重要的肾脏保护因子。血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂(Angiotensin Ⅱ receptor angtagonist，ARB)目前已应用于DN的临床治疗，主要是通过其血流动力学保护肾脏，在抑制肾间质纤维化方面的机制并不明了，冬虫夏草作为一种中药制剂对于肾脏的保护作用机制更是扑朔迷离。本课题通过研究糖尿病肾病大鼠模型肾组织中α-SMA、BMP-7和TGF-β的表达情况，以及替米沙坦联合冬虫夏草干预下三者的表达情况，同时观察24小时尿蛋白定量和肾功能的变化，以此探讨其对于糖尿病肾病肾小管上皮间充质转分化的调节作用，并寻找替米沙坦联合冬虫夏草对于糖尿病肾病的保护机制，为糖尿病肾病的治疗提供更多的途径及理论依据。
　　 目的：
　　 通过研究糖尿病肾病大鼠模型肾组织中α-SMA、BMP-7和TGF-β的表达情况，以及替米沙坦联合冬虫夏草干预下三者的表达情况，同时观察24小时尿蛋白定量和肾功能的变化，以此探讨其对于糖尿病肾病肾小管上皮间充质转分化的调节作用。
　　 方法：
　　 选用雄性Wistar大鼠作为实验对象，动物模型建立使用链脲佐菌素对大鼠一次性腹腔内注射，造模成功后，将大鼠随机分为4组：DN模型组(n=9)、替米沙坦组(n=9)，冬虫夏草组(n=9)，替米沙坦联合冬虫夏草组(n=10)，另设正常对照组(n=10)。替米沙坦组每日给予8mg/kg体重的替米沙坦灌胃一次；冬虫夏草组按药量2.5g/Kg虫草水提取液灌胃给药；联合治疗组两种药物均等量灌胃，对照组与模型组以等量饮用水灌胃，每日一次。所有大鼠不限食水。治疗8周后，对大鼠收集24小时尿量测定尿蛋白定量；心包取血测定血糖、血尿素氮、肌酐水平;处死大鼠后采集肾脏标本，测量大鼠肾重及肾重体重比；肾组织HE染色，测定各组大鼠肾小管-间质病理损伤评分，利用组织免疫化学法检测各组大鼠肾组织中BMP-7、α-SMA和TGF-β的表达情况。
　　 结果：
　　 (1)对血中BUN、SCr的影响：替米沙坦组、冬虫夏草组及联合用药组能明显降低BUN、SCr水平，与模型组比较有显著性差异(P<0.01)，但仍高于正常对照组；联合用药组与替米沙坦组、冬虫夏草组比较有显著性差异(P<0.01)；替米沙坦组与冬虫夏草组比较差异无显著性意义(P>0.05)。
　　 (2)对24小时尿蛋白的影响：替米沙坦组、冬虫夏草组及联合用药组能明显降低24小时尿蛋白水平，与模型组比较有显著性差异(P<0.01)，联合用药组与替米沙坦组、冬虫夏草组比较有显著性差异(P<0.01)；替米沙坦组与冬虫夏草组比较有显著性意义(P<0.01)。
　　 (3)肾组织病理：替米沙坦组、冬虫夏草组及联合用药组大鼠与正常对照组大鼠相比，出现了不同程度肾小球硬化、肾间质炎症细胞浸润、肾小管上皮细胞空泡变性及间质纤维化，肾小管-间质损伤指数明显升高(P<0.01)，与DN组对比则明显减轻(P<0.01)。
　　 (4)肾组织免疫组化：替米沙坦组、冬虫夏草组及联合用药组大鼠肾间质α-SMA及TGF-β阳性表达与模型组相比均显著下调(P<0.01)，BMP-7的阳性表达则显著上调(P<0.01)，联合用药组与替米沙坦组、冬虫夏草组比较有显著性差异(P<0.01)；替米沙坦组与冬虫夏草组比较差异无显著性差异(P>0.01)。
　　 (5)α-SMA及TGF-β与24小时尿蛋白定量和肾功能成明显正相关(P<0.01)；BMP-7与24小时尿蛋白定量和肾功能明显负相关(P<0.01)：α-SMA与TGF-β呈明显正相关(P<0.01)：BMP-7与α-SMA及TGF-β呈负相关，结果具有统计学意义(P<0.01)。
　　 结论：
　　 1.糖尿病肾病模型组α-SMA表达明显升高，提示糖尿病肾病过程存在肾小管上皮细胞间充质转分化；
　　 2.α-SMA表达上调与TGF-β明显相关，提示TGF-β可诱导α-SMA的表达，促进EMT的发生：
　　 3.BMP-7与TGF-β、α-SMA表达明显负相关，提示BMP-7可能通过抑制TGF-β的表达，从而抑制EMT的进展；
　　 4.替米沙坦、冬虫夏草可以减少肾组织α-SMA，抑制EMT的发生发展，延缓和改善肾间质纤维化，且联合使用效果更佳。