拟南芥乙烯生物合成因子调节NaCl诱导ROS代谢机制

摘要

乙烯不仅调节植物种子萌发、根伸长、开花、结果、叶片衰老等发育过程，而且调节植物胁迫反应。1-氨基环丙烷-1-羧酸(1-Aminocyclopropane-1-Carboxylic Acid，ACC)是乙烯前体物质，ACC合酶(ACC Synthase，ACS)是ACC合成限速酶。研究表明，乙烯信号通路与NaCl诱导的ROS代谢途径之间存在着信号交叉，但其机制尚需研究。
　　 本研究分析ACS家族12个成员中较为活跃的2个因子(AtERNA和AtERNB)功能。从美国拟南芥种子资源中心(ABRC)购买T-DNA插入功能缺失纯合突变体aterna、aternb种子，并通过遗传杂交技术创建aternaernb双突变体。表型观察发现：正常情况下，3种突变体aterna、aternb、aternaernb种子萌发率没有明显差别，都能够达到95％以上；120mM NaCl处理导致aterna、atrernb以及aterna/b萌发率显著高于WT，而且其幼苗根伸长显著大于WT。初步表明，ERNA和ERNB调控拟南芥对盐胁迫的应答。通过RT-PCR方法检测WT中2个基因的mRNA含量，结果显示：NaCl处理下WT根中ERNA和ERNB转录活性显著升高，推测ERNA/B参与盐胁迫应答。
　　 盐胁迫会改变植物细胞内的ROS代谢平衡，并导致ROS积累。检测atrerna、aternb、aternaernb根部ROS产生与积累情况；利用DAB染色观察H2O2产生与积累，结果显示：120mM NaCl处理时，WT与突变体幼苗根部伸长区棕褐色加重，表明H2O2积累量增多，但是atrerna、aternb、aternaernb突变体根部伸长区H2O2积累量低于WT。在H2O2荧光探针标记条件下，confocal扫描结果显示：同样处理下，atrerna、aternb、aternaernb根中伸长区荧光强度值要明显低于WT根尖。此结果与DAB染色结果一致。研究证明植物根的生长发育与伸长区H2O2以及分生区O2-分布比例有关，接着利用NBT(Nitro-Blue tetrazolium chloride)染色观察O2-产生与积累情况，结果显示：WT幼苗根部分生区蓝色变浅，表明O2-积累量降低，而aterna、aternb和aternarnb分生区颜色变深，表明O2-积累量增加。这一结果说明AtERNA和AtERNB通过减少伸长区H2O2积累和增加分生区O2-积累来应答盐胁迫。
　　 进一步检测ROS代谢酶活性。第一，通过RT-PCR技术，对编码过氧化物酶的关键基因PER34转录水平进行检测。处理前，WT与突变体根部PER34的mRNA水平没有显著差异，120mM NaCl处理4小时后，aterna、aternb、aternaernb根部PER34转录水平明显高于WT。说明在盐胁迫下，AtERNA和AtERNB可能通过影响过氧化物酶关键基因的表达来调节盐诱导的ROS产生。同时也检测了与ROS产生相关的NADPH氧化酶(AtRbohD和AtRbohF)活性。第二，利用组织化学定位技术观察ERNA/B对AtRbohD和AtRbohF活性的影响。首先获得RbohD/F：GUS分别转WT、aterna、aternb、aternaaternb的转基因植株。GUS染色和酶活性检测结果显示：NaCl处理导致WT根部RbohD和RbohF表达略有上升，RbohD/F：GUS酶活性略有增强；而在erna、ernb、ernaernb根部RbohD和RbohF表达明显上升，3个突变体株系根部RbohD：GUS酶活性分别升高41％、43％、40％，而相应的RbohF：GUS酶活性分别升高44.4％、60％、63.3％；由此可以看出，RbohF表达增加量高于RbohD。第三，H2O2清除酶CAT(catalase)活性测定显示，NaCl处理后，WT、aterna、aternb、aternaernb中CAT活性都升高，但3个突变体株系中CAT活性明显低于WT。这说明，AtERNA和AtERNB通过调节CAT活性影响ROS清除应答盐胁迫。这些结果暗示拟南芥根部AtERNA和AtERNB通过增强ROS产生酶活性和降低ROS清除酶活性来调节盐胁迫应答。
　　 总之，AtERNA和AtERNB通过增强ROS合成酶活性和抑制ROS清除酶活性进而使根尖伸长区H2O2积累减少，分生区O2-积累升高，从而调控盐胁迫下拟南芥根生长。