人参皂苷Rg1及其代谢产物Rh1、Ppt生精保护作用的分子机制研究

摘要

随着工业化、城市化的迅速推进和环境污染的加剧,近年来人类的生殖健康正面临着前所未有的挑战,不育症发病率不断增加,男性精子细胞质量整体水平降低。据统计,50年间全球男子的精子密度下降了一半,平均每年下降1％。据此类推,几十年之后,人类甚至可能会出现“无精危机”,有研究者将其称为席卷全球的精子滑坡。但迄今为止,世界上尚无一种有确切疗效、能从精子的质和量两方面促进双优的药物。这成为生殖医学领域一个亟待解决的难题。
　　人参中的有效成份包括皂苷类、小分子肽和多肽、多糖等,以人参皂苷(ginsenoside) Rg1研究最多。本课题研究组在近年先后发现:1. Rg1可显著提高棉酚所致的精子数目下降,增强受损伤的精子活力。2.服用Rg1后,不但受损伤的生精能力得以改善,而且效果优于正常对照大鼠。3.Rg1虽然对老年大鼠的精子活力没有明显的改善作用,但可提高老年大鼠的精子数量。4.Rg1可提高冷冻应激下受损伤的大鼠精子活动能力。而且实验中我们还发现Rg1的代谢产物Rh1、Ppt亦具有同样作用,与Rg1给药组并没有显著差异,这意味着Rg1在体内的作用时间将大大延长,同时糖基的解除也使Ppt的化学合成成为可能,这将大大降低Rg1的应用成本。相关结果已申请了专利保护,并获得了国家自然基金资助。本研究将对上述药效作用的作用机制进行深入探讨。
　　本研究分别用棉酚(gossypol)和玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEA)造成两种生精障碍的动物模型,以不同病理机制模型探讨Rg1及其代谢产物Rh1、Ppt的生精作用机制。研究内容主要包括:1.制作棉酚和玉米赤霉烯酮生精障碍模型。2.Rg1及其代谢产物对cAMP(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)/CREM(cAMP-responsive element modulator,CREM)信号传导通路的作用;3.Rg1及其代谢产物对睾丸组织和精子能量代谢系统的作用;4.Rg1及其代谢产物对棉酚所造成的睾丸组织损害的改善作用的形态学检测。
　　以棉酚为生精障碍模型的实验结果显示,棉酚50mg/kg,隔天一次,共给药两周后,大鼠附睾尾精子计数、精子活力均显著下降,证明生精障碍模型的形成。而且,实验还观察到棉酚可导致大鼠体重显著下降,Rg1及其代谢产物虽具有改善趋势,但不能使其恢复至正常水平。
　　而以玉米赤霉烯酮为工具药制作生精损伤模型模型的数据显示,无论精子活力分级还是精子数量、活动度,玉米赤霉烯酮给药组与对照组均没有显著性差异,所以玉米赤霉烯酮可能仅仅造成了文献所报道的睾丸组织的细胞凋亡,但尚没有达到影响精细胞活力和数量的程度。故在本研究后续试验中没有采用此模型。
　　大鼠口服给药后2周,采用放射免疫方法测得棉酚组精子细胞中cAMP明显升高,而Rg1、Rh1、Ppt可使精子细胞中cAMP含量较模型组显著降低,恢复至正常水平。但在睾丸组织,棉酚却导致cAMP含量显著下降,而Rg1、Rh1、Ppt可使降低的cAMP水平明显升高,并伴随CREM表达的显著升高。所以Rg1、Rh1、Ppt等对cAMP/CREM信号通路的调节作用体现出针对不同部位的局域性作用,此作用特点体现了Rg1作用的多样性和双向调节作用特点。cAMP和Ca2+是决定精子活力的重要因素,我们实验发现棉酚使精子细胞内Ca2+显著低于正常组,而Rg1、Rh1、Ppt组钙离子浓度值与模型组相比有显著性升高(P<0.05),但不能恢复至正常组水平(P<0.05),所以棉酚对精细胞内钙离子有抑制作用,而Rg1及其代谢产物能对抗棉酚的抑制作用。
　　睾丸组织能量代谢相关酶活力的研究中, Rg1等对乳酸脱氢酶( lactate dehydrongenase,LDH)的影响较显著,结果显示棉酚使 LDH活性明显升高,而Rg1及代谢产物可使之恢复至正常水平(P<0.05)。同工酶电泳结果亦显示,模型组乳酸脱氢酶同工酶与其他各组有显著差异(P<0.01),提示棉酚使LDH过度活化,而Rg1及代谢产物均可LDH恢复正常,从而使睾丸组织维持正常的能量代谢水平。参与三羧酸循环、脂肪酸β-氧化和线粒体呼吸链的几种酶的活力结果显示,异柠檬酸脱氢酶( isocitrate dehydrongenase,ICDH)、β-羟脂酰辅酶A脱氢酶(β-hydroxyacyl-CoA dehydrongenase, HAD)、细胞色素氧化酶(cytochrome c oxiase,COX)等的活力未见显著差异(P>0.05),因此,初步研究结果显示,睾丸三羧酸循环、脂肪酸β-氧化和线粒体呼吸链的几种能量代谢相关酶并非为Rg1及其代谢产物Rh1、Ppt的重要作用靶点,其作用看起来更倾向于双向调节,维持机体的平衡,精细胞cAMP和钙离子的变化,以及LDH的变化都说明了这点。
　　Rg1及其代谢产物 Rh1、Ppt对精细胞线粒体膜电位( mitochondrial membrane potential,MMP)作用的检测结果显示,Rg1、Rh1、Ppt对精子线粒体膜电位有显著性升高作用(P<0.05),提示其有促进精子获能的作用。活性氧(reactive oxygen species, ROS)检测结果则表明,Rg1等给药组的活性氧水平有显著性降低(P<0.05),提示其对精子细胞有明显保护作用,以避免过高的活性氧水平对精子细胞造成损伤。
　　HE染色结果表明,Rg1、Rh1、Ppt对棉酚引起的睾丸组织的结构损伤有不同程度的修复作用,从形态学角度直观显示了其对生精障碍的保护作用。
　　迄今为止,尚未见到关于人参皂苷Rg1及其代谢产物对于生精保护作用和分子机制研究为国内外的首次发现,本研究组已有专利保护,本课题首次从药理学角度阐明Rg1体内作用的物质基础,为Rg1的体内代谢动力学研究做出贡献。本研究将为人参的临床应用、为Rg1由实验室走向临床打下坚实理论和实践基础。为开发具有自主知识产权的天然生精药物提供实验依据,为生精药物的研发和应用奠定基础。

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前 言?

第一部分 棉酚与玉米赤霉烯酮对大鼠附睾精子质量影响的比较

材料与方法

实验结果

讨论

小结

第二部分 Rg1及其代谢产物Rh1、Ppt对cAMP/CREM信号通路的影响

材料与方法

实验结果

讨论

小结

第三部分 Rg1及其代谢产物Rh1、Ppt对大鼠睾丸组织能量代谢相关酶活力的影响

材料与方法

实验结果

讨论

小结

第四部分 Rg1及其代谢产物Rh1、Ppt对附睾精子线粒体能量系统的影响

材料与方法

实验结果

讨论

小结

第五部分 Rg1及其代谢产物Rh1、Ppt对大鼠睾丸组织形态结构的影响

材料与方法

实验结果

讨论

小结

文献综述

参考文献

本研究的创新性分析

致谢

攻读学位期间待发表的学术论文