基于PDGFR/JAK2/STAT3通路探讨痛愈舒颗粒对寒凝血瘀型EMs大鼠在位内膜的调控机制

摘要

目的：
　　1.基于伏寒理论建立寒凝血瘀型EMs大鼠模型，并对模型进行综合评价，为中医EMs病证结合大鼠模型的建立提供基础。
　　2.探索EMs性不孕症发病的可能通路，即PDGFR/JAK2/STAT3信号通路，探索痛愈舒颗粒治疗寒凝血瘀型EMs大鼠不孕的可能中西医机制，观察不同剂量的痛愈舒颗粒对寒凝血瘀型EMs不孕的影响，与西药比较其对EMs不孕的治疗效果。
　　3.为EMs不孕的病因病机“伏寒伤肾，致瘀损络，胞宫络伤，肾虚不孕”理论提供实验依据。
　　4.预防性用药干预寒凝血瘀型EMs大鼠模型，为临床EMs腹腔镜术后促进受孕提供有效的方法。
　　方法：
　　1.实验一:将SPF级雌性未交配SD大鼠30只，随机分为冰水浴7天组10只，冰水浴14天组10只，空白对照组10只。用冰水浸泡+皮下注射盐酸肾上腺素法建立寒凝血瘀型大鼠模型，分别于冰水浴第7天及第14天，皮下注射0.1％盐酸肾上腺素。第2日观察各组大鼠的中医证候表象，所有大鼠均采用心脏取血的方式取血，行凝血功能及血液流变学检查，以确定大鼠寒凝血瘀模型建立成功的时间。
　　2.实验二:将SPF级雌性未交配SD大鼠80只，随机选取10只为空白对照组，仅开腹找到子宫，用生理盐水冲洗腹腔后，缝合腹壁。其余大鼠均为模型组，按实验一方法先建立寒凝血瘀大鼠模型，后采用子宫内膜自体移植造模，并于造模1周后，刀口贴医用防水胶布再次冰水浸泡，日1次，连续1周，分别于术后3天、5天、1周、2周、3周、4周、6周、8周及12周，选取6只大鼠。比较各组大鼠的中医证候表象、病灶外观、子宫内膜病理、凝血功能及血液流变学，以确定寒凝血瘀型EMs大鼠的治疗性给药时间及预防性给药时间。
　　3.实验三:将SPF级雌性未交配SD大鼠126只，随机选取18只为空白对照组，其余大鼠均为模型组。模型组术后4周后开腹探查，取造模成功大鼠90只，随机分为模型4周组、模型8周组、中药低剂量组、中药中剂量组、中药高剂量组和西药组，每组15只，模型4周组术后4周择着床窗口期取材（阴道涂片见大量角化细胞后合笼，孕第4日取材），其余各组均在灌相应药物或生理盐水4周后择着床窗口期取材（具体方式同前）。观察各组大鼠的中医证候表象;所有大鼠心脏取血做性激素水平、凝血功能和血流变检查;各模型组大鼠取在位内膜及异位组织，空白对照组取右侧子宫组织分别作病理形态观察;免疫组化法检测在位组织中的HOXA10、PDGFR、p-JAK2、p-STAT3、VEGF的表达;Western Blot和RT-PCR检测在位组织中的HOXA10、PDGFR、p-JAK2、p-STAT3;以确定痛愈舒颗粒治疗性用药的最佳剂量。
　　4.实验四:将SPF级雌性未交配SD大鼠72只，随机抽选18只为空白对照组，其余大鼠均为模型组，按实验三方法造模。模型组于术后第5日随机开腹，将确认种植成功的15只大鼠设为预防组，给予痛愈舒颗粒最佳剂量灌胃，并于术后1周开始冰水浸泡，持续1周。术后4周随机开腹，取造模成功的大鼠分为模型8周组、最佳剂量组各15只，各组大鼠连续服药或生理盐水4周后择着床窗口期取材（具体方式同前）。所有大鼠的取材及检验项目与实验三相同。以确定痛愈舒颗粒预防性干预对寒凝血瘀型EMs内膜容受性的影响。
　　结果：
　　1.实验一:通过冰水浸泡14天结合皮下注射盐酸肾上腺素的方法可以成功制备寒凝血瘀型大鼠模型。
　　2.实验二:寒凝血瘀型内异症大鼠造模成功率为78.6％。术后3天，组织严重水肿;术后5天，与术后3天比较，组织水肿减轻，异位组织还未形成完整内膜上皮结构;术后4周，已具有典型的子宫内膜组织形态;术后6周、术后8周及术后12周与术后4周比较，病理表现相似，仍具有典型的子宫内膜组织形态。除术后12周外，各模型组大鼠均出现中医“寒凝血瘀”的表现，凝血功能和血流变出现相应变化。结合异位内膜的病理结果，确定术后4周为治疗性用药时间点，术后5天为预防性用药时间点。
　　3.实验三:本次实验的造模成功率为87.03％。各中药组灌药4周后，寒凝血瘀外观改善，精神状态好转，中中组和中高组大鼠的状态明显改善，而西药组证候表现变化不明显。各治疗组与模型4周组或模型8周组相比，病灶体积明显缩小，偶有病灶仅存一小块增生突起;异位内膜病理形态变化明显，上皮细胞排列不连贯，腺体数目减少，尤其中高组变化更明显，无腺体结构，无炎细胞浸润;在位内膜病理观察子宫内膜形态发生变化，内膜结构变的连续、完整，异常的子宫腺体数目减少，腺腔扩张程度减轻，结构疏松程度改善，以中药高剂量组变化更为明显，细胞形态接近正常子宫内膜。性激素水平上，其中雌二醇与空白对照组比较，各治疗组及模型组明显升高，与模型组比较，各治疗组明显下降，以中高组下降最明显;孕酮与空白对照组比较，各治疗组及模型组明显降低，与模型组比较，各治疗组明显升高，以中高组升高最明显。免疫组化结果显示，与空白对照组相比，各治疗组及模型组中PDGFR、p-JAK2、p-STAT3及VEGF的表达均升高，HOXA10的表达均降低;模型8周组与模型4周组相比，前四者的表达均升高，HOXA10的表达降低;各治疗组与模型组相比，前四者的表达均降低，HOXA10的表达升高，此五者的表达皆在中高组变化最为明显，同时PDGFR、p-JAK2、p-STAT3及VEGF的表达具有一致性。WB及PCR结果显示，与空白对照组比较，各治疗组与模型组HOXA10的表达明显下降，各治疗组用药后，HOXA10的表达较模型组均有所上升，以中高组升高最明显;与空白对照组比较，各治疗组与模型组PDGFR、p-JAK2、p-STAT3的表达明显升高，三者在模型8周组中的表达高于模型4周组，各治疗组用药后，三者的表达较模型组均有所下降，皆以中高组最为明显。
　　4.实验四:本次实验的造模成功率为88.89％。预防组大鼠未见寒凝血瘀的表征。中高组、预防组同模型8周组比较，异位病灶明显萎缩变小，与周围组织粘连明显减轻，其中预防组变化更为显著。两治疗组的异位内膜病理变化显著，与中高组比较，预防组的血管数目更少。两治疗组的在位内膜病理接近正常子宫内膜，与中高组比较，预防组的内膜结构更加连续、完整。两治疗组的凝血功能及血流变检测无明显差异，性激素水平则以预防组降低雌二醇、升高孕酮更明显。组化结果显示，中高组和预防组均可明显降低PDGFR、p-JAK2、p-STAT3、VEGF在子宫在位内膜中的表达，升高HOXA10的表达，其中预防组效果更显著。WB及PCR结果显示，PDGFR蛋白及其mRNA的表达在模型8周组均高于两治疗组，预防组的表达明显低于中高组;p-JAK2、p-STAT3在各组的变化与PDGFR相一致;HOXA10蛋白及其mRNA的表达在模型8周组均低于两治疗组，预防组的表达明显高于中高组。
　　结论：
　　1.通过冰水浸泡结合皮下注射盐酸肾上腺素再结合自体子宫内膜移植的方法，成功的建立了寒凝血瘀型病证结合的EMs大鼠模型。
　　2.提出了“伏寒伤肾，致瘀损络，胞宫络伤，肾虚不孕”为寒凝血瘀型EMs性不孕之病机关键。
　　3.PDGFR蛋白及其mRNA在内异症着床窗口期的在位内膜中表达明显升高，推测PDGFR的高表达可能对内异症性不孕产生不良影响，痛愈舒颗粒可以抑制PDGFR的高表达，可有效改善寒凝血瘀型内异症大鼠子宫内膜容受性，预防性应用效果更佳。

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