重组人血管内皮抑素对白血病K562及K562/A02细胞株增殖及凋亡的影响

摘要

研究背景：
　　慢性粒细胞白血病(Chronic Myelocytic Leukemia, CML)是一种获得性造血干细胞恶性疾病,是最常见的骨髓增殖性疾病。主要特点是t(9;22) q(34;11)基因异位从而导致
　　BCR-ABL融合基因的产生,形成费城染色体为主要特点。BCR-ABL融合基因编码肿瘤蛋白P210 BCR-ABL并具有抗凋亡活性。与CML的发病原因有关。甲磺酸伊马替尼(Imatinib mesylate,IM,Gleevec,格列卫)依赖性与非依赖性耐药机制可导致IM治疗失败。第二代第三代酪氨酸激酶抑制剂(Tyrosinekinase Inhibitor,TKI)虽已经被FDA批准用于治疗CML,但价格昂贵,所以使用仍有局限性。越来越多的数据显示,新生血管参与了白血病的发生及进展。抗白血病患者骨髓血管新生成为白血病治疗的切入点之一。肿瘤进展直接与细胞的增殖与死亡不平衡有关。细胞凋亡机制的缺陷可导致CML恶性表型的产生。目前已知的抗凋亡蛋白家族中,BCL-2家族成员BCL-XL与BCL-2均为抗细胞凋亡蛋白,在癌症与肿瘤中,BCL-2、BCL-XL均存在过表达现象。
　　目的：
　　1.研究重组人血管内皮抑素(Recombinant Human Endostatin, rhES)对慢性粒细胞白血病细胞株K562及慢性粒细胞白血病多药耐药细胞株K562/A02增殖抑制作用。
　　2.研究K562、K562/A02细胞株经rhES作用后,观察相关凋亡蛋白BCL-2、BCL-XL及血管内皮生长因子VEGF表达的影响。
　　研究方法:
　　1.以K562细胞及K562/A02细胞株为实验细胞,放置于37℃,5％CO2细胞培养箱中培养,直至其生长稳定。显微镜下观察K562及K562/A02细胞的细胞形态、生长状态;计数法绘制细胞生长曲线。
　　2.CCK-8检测0、10、20、50、100、200和400μg/ml的rhES作用K562、K562/A02细胞6-72小时后的细胞活性并计算IC50。
　　3.IC50浓度作为作用浓度作用于K562、K562/A02细胞株,使用流式细胞术检测经rhES作用后K562、K562/A02凋亡率。
　　4.使用Elisa及实时荧光定量RT-PCR检测BCL-2、BCL-XL、VEGF的表达。
　　结果:
　　1.CCK-8结果显示,rhES对K562、K562/A02细胞株有诱导细胞凋亡的作用。K562、K562/A02细胞株24小时后,细胞生长抑制50%的浓度(IC50)为100μg/ml,48小时后细胞生长抑制50%的浓度(IC50)为200μg/ml。
　　2.rhES作用K562、K562/A02细胞后,经流式细胞术检测:100μg/ml与200μg/ml rhES作用于K562细胞24h,细胞凋亡率分别为13.60%和14.84%,作用于K562细胞48h后,细胞凋亡率分别为20.02%和23.64%。100μg/ml与200μg/ml rhES作用于K562/A02细胞24h,细胞凋亡率分别为10.97%和16.57%,作用于K562/A02细胞48h后,细胞凋亡率分别为13.33%和15.42%。
　　3.Elisa与RT-PCR检测结果显示,100μg/ml、200μg/ml rhES分别作用K562、K562/A02细胞24h、48h后,BCL-2、BCL-XL、VEGF的表达均有下降,与未加药物组相比差异具有显著的统计学意义(P<0.05)。
　　结论:
　　1.rhES在体外不仅可以抑制K562细胞增殖并诱导其凋亡,同样对白血病多药耐药细胞株K562/A02有增殖抑制及诱导凋亡的作用。
　　2.rhES可降低K562、K562/A02细胞中BCL-2,BCL-XL,VEGF的表达(P<0.05)。

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1 引 言

2 实验材料

2.1细胞株

2.2主要试剂

2.3主要仪器与设备

2.4主要溶液的配制(包括本研究所有用到的常用溶液)

3 实验方法

3.1基础研究技术路线

3.2 K562、K562/A02 细胞培养

3.3 K562、K562/A02细胞的生长曲线

3.4 细胞增殖抑制率测定（CCK-8）

3.5 细胞凋亡率的测定

3.6 TRIzol法提取细胞mRNA

3.7引物设计

3.8 cDNA的合成

3.9 RT-PCR检测K562、K562/A02细胞内VEGF、BCL-XL、BCL-2相关基因的表达

3.10 蛋白提取

3.11 Elisa方法测定细胞中的VEGF、BCL-XL、BCL-2蛋白表达的变化

3.12 统计学处理

4 实验结果

4.1 K562、K562/A02细胞的细胞形态及生长特点

4.2 细胞的生长曲线和倍增时间

4.3 K562、K562/A02细胞的IC50值

4.4 rhES对细胞凋亡的影响

4.5 RT-PCR检测K562、K562/A02细胞内VEGF、BCL-XL、BCL-2相关基因的表达

4.6 Elisa方法测定细胞中的VEGF表达

讨论

结论

文献综述

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的学术论文目录及获得奖励