米曲霉产中性蛋白酶高产菌株的选育及其发酵条件优化

摘要

中性蛋白酶是一类最适作用pH为6.5~7.5的蛋白酶,它能将大分子蛋白质水解为肽类和游离氨基酸,被广泛应用于医药、食品和皮革等行业。
　　本论文以米曲霉H0作为出发菌株,经紫外线、DES复合诱变,通过干酪素培养基筛选,得到一株中性蛋白酶高产菌株H2-5,其酶活力达到2158 U/g,传代培养10代,菌株遗产稳定性能良好。
　　确定了该菌株复合诱变的条件为:15 W紫外灯照射,距离为25 cm,照射时间为120 s;DES诱变浓度为2％,诱变时间15 min。通过复合诱变,筛选出一株产中性蛋白酶酶活力较高的菌株H2-5,其酶活较出发菌株提高了108.5%。
　　研究了发酵培养条件对菌株的产酶影响:其中碳氮源、培养时间、培养温度、料水比及培养基初始pH值等对酶活影响较大;活性剂、无机盐对酶活也有影响。通过单因素实验确定了培养基组成为:碳源为麦麸、氮源为豆粕、碳氮比为4:1、料水比为5:4,确定了培养条件为:培养时间为84 h、初始培养基pH值为7.5、活性剂为吐温-80、无机盐为KH2PO4和Na2HPO4、培养温度为30~32℃(前36 h为32℃,后期温度为30℃),还确定了Ca2+对酶活的抑制作用。
　　研究了以单因素实验结果为参照,利用响应面实验来确定多因素对米曲霉产中性蛋白酶的影响。通过响应面实验结果可知,发酵培养基的最适配方为:麦麸13.42 g,豆粕3.45 g,料水比1.29,中性蛋白酶产量为5561.76 U/g,经过验证实验检测酶活力为5604 U/g,发现模型能比较好的预测实际发酵产酶情况。
　　研究了米曲霉高产菌株在大豆发酵中的应用,使其游离氨基酸量提高30%以上。

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1前 言

1.1 米曲霉

1.1.1 米曲霉在工业生产中的应用

1.1.2 米曲霉发酵方式的选择

1.2 蛋白酶

1.3 中性蛋白酶

1.3.1 中性蛋白酶的来源

1.3.2 中性蛋白酶的应用

1.3.3 中性蛋白酶的发展趋势

1.4 立题依据

1.5 本课题的研究内容

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 菌种

2.1.2 培养基

2.1.3 主要试剂

2.1.4 主要仪器

2.2 试验方法

2.2.1 培养方法

2.2.2 分析方法

2.2.3 米曲霉生产菌株的诱变育种

2.2.4 遗传稳定性测定

2.2.5 米曲霉高产中性蛋白酶培养基的优化

2.2.6 正交试验优化产游离氨基酸培养基的组成

3 结果与讨论

3.1 米曲霉高产中性蛋白酶菌株的诱变育种

3.1.1 紫外线诱变

3.1.2 硫酸二乙酯（DES）诱变

3.1.3 传代培养

3.1.4 小结

3.2 米曲霉高产中性蛋白酶菌株培养条件的优化

3.2.1 培养时间对对产中性蛋白酶的影响

3.2.2 不同氮源对产中性蛋白酶的影响

3.2.3 不同碳源对产中性蛋白酶的影响

3.2.4 碳氮比(C/N)对产中性蛋白酶的影响

3.2.5 温度对对产中性蛋白酶的影响

3.2.6不同比例的干物质与水(即料水比)对产中性蛋白酶的影响

3.2.7 pH值对产酶的影响

3.2.8 表面活性剂对产酶的影响

3.2.9 无机盐对产中性蛋白酶的影响

3.2.10 响应面法优化米曲霉培养基

3.3 中性蛋白酶在大豆发酵中的应用

3.4 小结

4 结 论

5 展 望

参考文献

致谢