表没食子儿茶素没食子酸酯联合表柔比星对膀胱癌5637细胞株生长抑制作用

摘要

膀胱尿路上皮癌占膀胱恶性肿瘤90％以上,而非浸润性尿路上皮癌约占其中的70%。虽然TURBt治疗非浸润性膀胱癌后可采用膀胱灌注化疗预防肿瘤复发,但其术后复发率仍然偏高,而且部分非浸润性尿路上皮癌仍有进展为浸润性癌的可能。膀胱肿瘤高复发因素包括膀胱肿瘤多中心生长、手术导致肿瘤细胞脱落种植、残余病灶及肿瘤多药耐药性(multidrug resistance,MDR),其中MDR正是膀胱肿瘤TURBt后膀胱灌注化疗失败的重要因素之一。核转录因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)对众多基因起中心性转录调节作用,参与炎症、免疫、细胞增殖、分化、凋亡、恶化、肿瘤浸润、MDR等多种生物学过程。多数抗肿瘤药物作用肿瘤细胞后可激活 NF-κB,使其下游基因被激活,使肿瘤细胞逃避抗肿瘤药物的杀伤作用,从而产生肿瘤耐药。表柔比星(Epirubicin, EPB)是临床膀胱癌TURBt术后膀胱灌注化疗常用药物之一,但EPB并不能完全有效预防膀胱癌术后复发。造成膀胱癌术后复发的原因可能与 EPB诱导肿瘤细胞NF-κB活化,导致肿瘤细胞出现 MDR有关。表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate,EGCG)为茶多酚中主要的活性成份,多项研究表明EGCG能够抑制NF-κB的激活。本课题应用不同浓度的EGCG和/或EPB处理膀胱癌细胞系5637,观察膀胱癌5637细胞株生长状态变化及对NF-κB活化的影响。
　　目的:分析EGCG和EPB联用对高危非浸润性膀胱癌细胞系5637生物学行为的作用效果及NF-κB的影响,探讨两药联合对膀胱癌细胞的毒性协同作用及分子机制,为进一步指导临床膀胱癌治疗提供新的思路及理论依据。
　　方法:选用高危非浸润性膀胱癌5637细胞株作为研究对象。应用5~100μg/ml EGCG、1~50μg/ml EPB、EGCG(10μg/ml)和EPB(1μg/ml)联用处理高危非浸润性膀胱癌细胞系563724h后,MTT法检测细胞活性;流式细胞仪(flow cytometer,FCM)法检测细胞凋亡;细胞免疫组化、Western免疫印迹法及免疫荧光激光共聚焦法检测细胞质及细胞核中NF-κB的表达。
　　结果:
　　(1)MTT法检测结果显示EPB、EGCG随药物浓度的增高,对膀胱癌5637细胞株生长抑制率逐渐增高。联合应用两药后对膀胱癌5637细胞生长抑制率较相同浓度单用药物组有明显增高(P<0.05)。当1μg/ml EPB联合10μg/mlGCG时两药呈现出协同作用(Q>1.15),组间差异有统计学意义(P<0.05)。
　　(2)FCM显示1μg/ml EPB联合10μg/ml EGCG时对膀胱5637细胞促凋亡作用大于单用1μg/ml EPB或10μg/ml EGCG(P<0.05)。
　　(3)细胞免疫组化、Western免疫印迹法及激光共聚焦法显示1μg/ml EPB作用后细胞质中NF-κB减少,细胞核中NF-κB增加,当与10μg/ml EGCG联合应用时,NF-κB的细胞核内表达量显著下降。
　　结论:
　　(1)EGCG联合EPB对膀胱癌5637细胞株生长抑制作用大于相同剂量的单药组,且当1μg/ml EPB联合10μg/ml EGCG时可呈现协同效应;
　　(2)EGCG联合EPB对膀胱癌5637细胞株促凋亡作用大于相同剂量的单药组;
　　(3)膀胱癌5637细胞在EPB作用后出现NF-κB向细胞核内迁移,联合应用EGCG后这种迁移现象受到抑制,这一现象可能是药效增强的机制之一。

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前言

1 材料、试剂和仪器

1.1 实验对象

1.2 实验药物

1.3 主要仪器

1.4 主要试剂和药物

1.5 主要试剂配制

2 实验方法与步骤

2.1 细胞复苏、培养、传代、冻存

2.2 MTT法检测细胞的抑制率

2.3 流式细胞术检测凋亡率

2.4 细胞免疫组化检测NF-κB表达

2.5 Western印迹检测NF-κB表达

2.6 激光共聚焦（CLSM）检测NF-κB迁移现象[25]

2.7 统计分析

3 实验结果

3.1 MTT检测抑制率

3.2 流式细胞仪测定（FCM）

3.3 细胞免疫组化检测NF-κB/P65

3.4 Western印迹法检测NF-κB/P65

3.5 CLSM检测NF-κB/P65

讨论

结论

参考文献

文献综述

参考文献

致谢