EGFRvⅢ多肽致敏的DC-CTL对EGFRvⅢ+胶质瘤细胞的体外杀伤作用

摘要

背景:随着肿瘤学、免疫学的迅速发展，肿瘤的免疫治疗以其副作用小、耐受性好越来越受到人们的重视，成为继手术、放疗、化疗之后治疗肿瘤的又一种方法。树突状细胞(DC)是目前已知体内抗原递呈能力最强的APC，它可以通过多种途径介导免疫反应发挥抗肿瘤的作用，以DC为基础的肿瘤免疫治疗成为目前研究的重心。
　　表皮生长因子受体Ⅲ型突变体(EGFRvⅢ)是表皮生长因子(EGFR)最常见的突变体，在脑胶质瘤、胃癌、乳腺癌等恶性肿瘤中高表达，与肿瘤的发生、发展及预后密切相关。EGFRvⅢ具有配体非依赖性激活下游信号传导系统以及只在恶性肿瘤细胞中表达的特性，成为肿瘤靶向治疗良好的靶点。本研究体外制备DC，负载EGFRvⅢ多肽后，与T淋巴细胞共培养，刺激其增殖分化为细胞毒性的T淋巴细胞(cytotoxicTlymphocyte，CTL)，实现CTL特异性识别EGFRvⅢ阳性的脑胶质瘤细胞，体外验证其靶向性杀伤作用，探索胶质瘤等恶性肿瘤免疫治疗的新方法。
　　目的:检测人外周血中的单个核细胞体外培养分化为树突状细胞并负载EGFRvⅢ多肽后，诱导T淋巴细胞成为抗原特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的能力，并验证CTL对EGFRvⅢ+U87胶质瘤细胞的特异性杀伤作用。
　　方法:抽取健康志愿者的外周血，利用Ficoll淋巴细胞分离液、密度梯度离心法分离出单个核细胞(PBMC)，加入细胞因子IL-4、GM-CSF诱导其分化为不成熟的DC。在培养基中加入EGFRvⅢ多肽，不成熟的DC摄取抗原后发育为成熟的DC，流式细胞仪测定其表型变化。从外周血获得T淋巴细胞，加入细胞因子IL-2刺激其增殖，并与成熟的DC混合培养，使T淋巴细胞不断增殖、活化为CTL。将EGFRvⅢ+U87细胞、U87细胞这2种胶质瘤细胞作为靶细胞加入96孔培养板中培养24小时，然后按效靶比20∶1加入2种效应细胞，即用EGFRvⅢ活化的CTL和单加IL-2培养的T淋巴细胞，同时设置3个对照组，细胞毒试验组和对照组均设置3个复孔，培养12h后加入MTT，再继续培养4h，酶标仪测每孔的OD值，测量波长490nm，计算杀伤率。
　　结果:从外周血分离获得的单个核细胞培养3h后，倒置显微镜下观察，大多数细胞呈圆形、成簇排列，贴壁生长。取少量细胞计数，健康人1ml静脉血可获得1.4×106个单核细胞，吸出悬浮细胞，并加入含10％FBS、50ng/mlIL-4、500ng/mlrhGM-CSF的RPMI1640培养液。培养24h后，贴壁细胞减少，悬浮细胞增多，倒置显微镜下观察可见部分细胞聚集成团;培养48h后，细胞的形态开始变得不规则，悬浮细胞逐渐增多;3d时细胞表面伸出许多短小的毛刺样突起，体积增大，簇状生长，呈小集落样;至5、6d时DC表面的毛刺样突起较前增长、增粗，体积增大，悬浮细胞增多;培养至7d，细胞体积增大，形态各异，大小不等，有的粗短，有的细长，大部分呈悬浮生长，分布比较均匀，出现典型的树突状突起。DC的表型检测结果显示，DC的成熟性标志CD83的表达率仅为2.36％，DC的MHC-Ⅱ类分子HLA-DR的表达率为54.38％，CD80的表达率为9.27％，可见此时的DC处于未成熟状态。负载EGFRvⅢ多肽后再检测DC的表型，结果表明DC高表达CD83、HLA-DR及共刺激分子CD80，可见未成熟的DC经EGFRvⅢ多肽冲击后分化为成熟的DC。成熟的DC与T淋巴细胞混合培养后，刺激T淋巴细胞不断增殖，可使CD3+CD8+T细胞比率由5.4％提高到12.7％。负载EGFRvⅢ多肽的DC诱导的CTL对EGFRvⅢ+U87胶质瘤细胞的杀伤率(45.21±4.53)％明显高于单加IL-2培养的T细胞的杀伤率(12.30±2.15)％，差异较显著有统计学意义(P＜0.01);负载EGFRvⅢ多肽的DC诱导的CTL对U87细胞的杀伤率为(14.48±3.50)％，与单加IL-2培养的T细胞的杀伤率(18.10±4.16)％相比差异不显著(P＞0.05)。
　　结论:负载EGFRvⅢ多肽的DC诱导的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，具有特异性识别和杀伤EGFRvⅢ+U87胶质瘤细胞的功能，为胶质瘤的免疫治疗奠定了一定的实验基础。

目录

声明

摘要

英文缩略词表

引言

第一章 树突状细胞的培养、EGFRvⅢ多肽负载和T淋巴细胞的活化

1．1 序言

1．2 材料、试剂、仪器

1．2．1 材料

1．2．2 试剂

1．2．3 仪器

1．3 方法与步骤

1．3．1 树突状细胞的体外培养和EGFRvⅢ多肽负载

1．3．2 T细胞的激活和扩增

1．4 结果

1．4．1 外周血来源的DC的形态学特征

1．4．2 负载EGFRvⅢ多肽的DC表型检测

1．4．3 T淋巴细胞的增殖、活化

1．4．4 负载EGFRvⅢ多肽的DC与T淋巴细胞共培养引起CD3+CD8+T细胞比例的变化

1．5 讨论

第二章 EGFRvⅢ多肽诱导的CTL的特异性杀伤作用

2．1 序言

2．2 试剂、仪器与细胞

2．2．1 试剂

2．2．2 仪器

2．2．3 细胞

2．3 方法与步骤

2．3．1 MTT法检测CTL的特异性杀伤活性

2．3．2 统计学分析

2．4 结果

2．5 讨论

第三章 小结

参考文献

文献综述

致谢