牵牛子酒提取物对Lewis肺癌的抗肿瘤和抗转移机制研究

摘要

肺癌是目前世界上发病率和死亡率均排名第一的肿瘤。虽然近年来国内外在肿瘤生长和转移的研究上取得了较大的进展，但是目前还没有一种能够广泛应用于临床肿瘤转移防治的药物。从我国传统医学入手，积极地探索和研究中医药在防治肿瘤转移方面的作用、阐明其可能的抗肿瘤机制对创立肿瘤防治新方法有极其重要的意义。牵牛子，消痰涤饮、杀虫攻积、泻下通便，理论上符合中医肿瘤从痰论治的原则，有可能直接抑制肿瘤生长和引邪（肿瘤）外出，具有多方面抗肿瘤、抗转移作用。本研究的目的通过观察牵牛子对肿瘤生长和转移的作用，挖掘其独特的抗肿瘤优势，在整体、细胞、分子水平上研究其可能的的抗肿瘤机制，为中药防治肿瘤提供新思路。
　　本研究采用MTT实验法测定牵牛子酒提取物对Lewis肺癌细胞增殖的影响，细胞划痕实验测定牵牛子酒提取液对Lewis肺癌细胞的迁移率，吖啶橙染色检测细胞自噬，考察牵牛子酒提取物体外对肿瘤生长和转移的效果。建立Lewis肺癌小鼠皮下移植模型，电化学发光法检测荷瘤小鼠血清中癌胚抗原(CEA)及β2微球蛋白(β2-MG)含量，脾指数及胸腺指数检测机体免疫活性，肺表面转移瘤结节数检测肺转移，自主活动及生存期检测生存质量，考察牵牛子酒提取物体内抗肿瘤效果。荧光黄传输检测细胞间连接通讯，westernbloting检测细胞中水通道蛋白1(AQP1)的表达，免疫组化法检测肺转移小鼠肺脏AQP1和缝隙连接蛋白Cx43表达，探讨牵牛子的抗肿瘤机制。
　　体外实验结果显示:牵牛子酒提取物对体外培养的Lewis肺癌细胞呈剂量依赖性生长抑制作用，半数抑制浓度(IC50)为37.21μg·mL-1。牵牛子酒提取物能减少Lewis肺癌细胞低血清自噬、阻止细胞迁移，药物处理后的Lewis细胞分别迁移了20.5±3.1μm、46.8±4.2μm，同期正常细胞迁移121.3±8.6μm。
　　体内实验结果显示:牵牛子酒提取物能降低荷瘤小鼠血清CEA和β2-MG水平，明显抑制肿瘤生长，高剂量和低剂量抑瘤率分别为43.5％和38.2％。牵牛子酒提取物对实验性肺转移模型小鼠的肺癌转移有明显的阻止作用，与模型组小鼠比较，给药组小鼠生存期延长，自主活动能力较同时期模型组小鼠活动能力强，免疫器官指数无明显差异，显示出较好的生存质量。
　　机制研究结果显示:牵牛子酒提取物能够降低细胞AQP1蛋白，促进细胞间连接通讯，牵牛子酒提取物能减弱肺转移小鼠肺组织AQP1的阳性染色密度，增强Cx43的免疫组化染色深度。
　　综上所述，牵牛子酒提取物有确切的抑制肿瘤生长和抗转移作用，其机制可能与增强细胞间连接通讯和下调细胞水通道AQP1有关。

目录

声明

Abbreviation

摘要

第一部分 绪论

1．1 肺癌的治疗进展

1．1．1 手术治疗

1．1．2 放射治疗

1．1．3 化学治疗

1．1．4 中医药治疗

1．2 西医对肺癌的认识

1．2．1 肿瘤的侵袭和转移

1．2．2 肺癌转移的相关环节

1．2．3 肺癌转移的关键分子

1．3 中医对肺癌的认识

1．3．1 古代文献关于肺癌的记载

1．3．2 肺癌的发病机理

1．3．3 中医药抗肿瘤作用机制

1．3．4 痰与肿瘤的关系

1．4 立题依据

第二部分 牵牛子酒提取物体外抗肿瘤作用研究

2．1 实验材料

2．1．1 药品与试剂

2．1．2 试剂配制

2．1．3 实验细胞

2．1．4 主要仪器

2．2 实验方法

2．2．1 细胞的复苏和传代

2．2．2 细胞增殖检测

2．2．3 细胞划痕试验

2．2．4 细胞自噬检测

2．2．5 统计学分析

2．3 实验结果

2．3．1 对小鼠Lewis肺癌细胞增殖的影响

2．3．2 对小鼠Lewis肺癌细胞迁移能力的影响

2．3．3 对小鼠lewis肺癌细胞自噬能力的影响

2．4 实验小结

第三部分 牵牛子酒提取物体内抗肿瘤作用研究

3．1 实验材料

3．1．1 试剂与药品

3．1．2 试剂配制

3．1．3 实验瘤株

3．1．4 实验动物

3．1．5 主要仪器

3．2 实验方法

3．2．1 牵牛子酒提取物对Lewis肺癌细胞皮下移植小鼠模型的影响

3．2．2 牵牛子酒提取物对Lewis肺癌细胞实验性肺转移小鼠模型的影响

3．2．3 电化学发光法检测荷瘤小鼠血清癌胚抗原(CEA)和β2微球蛋白(β2-MG)

3．2．4 统计学分析

3．3 实验结果

3．3．1 对Lewis肺癌荷瘤小鼠生存状况的影响

3．3．2 对Lewis肺癌荷瘤小鼠免疫器官的影响

3．3．3 对Lewis肺癌皮下移植肿瘤的影响

3．3．4 对Lewis肺癌实验性肺转移小鼠生存状况的影响

3．3．5 对Lewis肺癌实验性肺转移小鼠免疫器官的影响

3．3．6 对Lewis肺癌实验性肺转移小鼠肺癌转移的影响

3．4 实验小结

第四部分 牵牛子酒提取物抗肿瘤作用机制研究

4．1 实验材料

4．1．1 试剂与药品

4．1．2 试剂配制

4．1．3 实验细胞与瘤株

4．1．4 实验动物

4．1．5 主要仪器

4．2 实验方法

4．2．1 荧光染料划痕标记示踪方法检测Lewis肺癌细胞细胞间连接通讯

4．2．2 Western Bloting检测Lewis肺癌细胞AQP1表达

4．2．3 免疫组化染色检测Lewis肺癌实验性肺转移小鼠肺脏水通道蛋白1(AQP1)和缝隙连接蛋白(Cx43)表达

4．2．4 统计学分析

4．3 实验结果

4．3．1 对Lewis肺癌细胞细胞间连接通讯的影响

4．3．2 对Lewis肺癌细胞AQP1表达的影响

4．3．3 对Lewis肺癌实验性肺转移小鼠肺脏AQP1和Cx43表达的影响

4．4 实验小结

第五部分 讨论

第六部分 实验结论

参考文献

致谢

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