生物材料对神经类细胞培养和生长分化的影响

摘要

组织工程是应用工程学和生命科学原理，研究和开发能够修复和改善损伤组织结构与功能的生物替代物的一门学科。它已经成为当今最热点的研究之一，而生物材料作为组织工程学重要要素之一，已经越来越受到重视。本论文对两种生物材料聚乳酸羟基乙酸(PLGA)和聚乙二醇(PEG)水凝胶分别表面加工处理，研究其对神经类细胞的培养和分化生成神经细胞的影响，主要包括PLGA对神经元细胞生长的影响，对PC12细胞生长及分化为神经细胞的影响;PEG水凝胶对诱导多功能干细胞(IPS)分化生成神经细胞的影响。为神经组织工程的临床应用提供基础。本论文所做的工作有:
　　(1)分离昆明白小鼠的神经原代细胞，培养并纯化，为生物材料表面对细胞黏附生长实验提供细胞源并作对照组。通过甲苯胺蓝染色和免疫荧光抗体染色实验，证明成功分离出昆明白小鼠的神经元细胞。
　　(2)分离原代小鼠胚胎成纤维细胞，并成功对细胞进行培养，传代，冻存及复苏，通过丝裂霉素处理后，为诱导多功能干细胞(IPS)培养做滋养层。结果表明在滋养层上可以良好的培养IPS细胞，多次传代，冻存，复苏后仍具有良好的细胞形态。
　　(3)以PLGA颗粒为基材，探究了PLGA薄膜的制备技术，制备了PLGA薄膜，碱处理后通过衰减全反射傅立叶转换红外(ATR-FTIR)波谱扫描测定其表面有羧基，然后采用碳化二亚胺(EDC-NHS)两步接枝法将多聚赖氨酸和不同浓度的神经生长因子(NGF)固定化到PLGA薄膜上，再分别用神经原代细胞和神经嗜铬细胞瘤(PC12)细胞株在处理后的PLGA薄膜上分别进行培养和诱导。通过罗丹明B对接枝蛋白前后的PLGA薄膜的标记处理，辅助于荧光染色照片和MTT法检测，对薄膜表面细胞的粘附情况和分化情况进行直观的描述。结果证明多聚赖氨酸和NGF因子都固定化到了PLGA薄膜上，并对原代细胞的培养和PC12细胞的诱导具有积极的作用。
　　(4)使用分子量为2000的分子两端有双键的PEG大单体聚乙二醇双丙烯酸酯(PEGDA)为原料，通过紫外光聚合技术制备出的PEG水凝胶薄膜，根据实验要求设计制备了转移试剂ACRL-PEG2000-RGDS，并利用此转移试剂和二次光聚合技术把黏附因子多肽RGDS接枝到PEG水凝胶薄膜上，使改性后的PEG水凝胶薄膜具有细胞黏附能力。通过MTT数据检测了改性后PEG水凝胶薄膜对PC12细胞的活性的影响。
　　(5)制备分子量为2000的PEG水凝胶，二次光聚合把RGDS和NGF接枝到PEG水凝胶薄膜上，通过对IPS细胞的诱导培养，特异性鉴定后证明在PEG水凝胶上接枝诱导因了使IPS细胞向神经细胞方向诱导生长方法可行。

目录

声明

摘要

1．引言

1．1 组织工程研究概论

1．2 组织工程用生物材料

1．2．1 PLGA研究概况

1．2．2 PEG水凝胶研究概况

1．3 种子细胞

1．4 细胞与材料的相互作用

1．4．1 材料表面图案化对细胞的影响

1．5 立题依据与研究目的

1．6 主要研究内容

1．6．1 神经原代细胞的分离

1．6．2 PLGA薄膜的制备

1．6．3 PLGA薄膜对神经类细胞生长分化生成的影响

1．6．4 PEG水凝胶的制备

1．6．5 PEG水凝胶对神经类细胞生长分化生成的影响

2 材料与方法

2．1 主要仪器和试剂

2．1．1 主要仪器

2．1．2 主要试剂

2．2 供试细胞株和培养基

2．2．1 供试细胞株

2．2．2 主要试剂及培养基的配置

2．3 小鼠原代神经元细胞的分离培养及鉴定

2．3．1 小鼠原代细胞的分离与培养

2．3．2 神经元细胞的鉴定

2．4 IPS细胞的培养和纯化

2．4．1 小鼠成纤维细胞的分离培养

2．4．2 滋养层的制备

2．4．3 IPS细胞的传代培养

2．4．4 IPS细胞的纯化

2．5 PLGA的制备

2．5．1 PLGA空白膜的制备

2．5．2 PLGA薄膜表面羧基化

2．5．3 ATR-FTIR检测PLGA表面羧基化

2．6 原代神经元在PLGA薄膜上的生长情况

2．6．1 PLGA表面蛋白接枝

2．6．2 PLGA表面接枝蛋白检测

2．6．3 PLGA薄膜的无菌处理

2．6．4 PLGA薄膜接种神经原代细胞

2．7 PLGA薄膜上诱导PC12细胞

2．7．1 MTT法测PLGA表面PC12细胞活性

2．7．2 PLGA表面接枝不同浓度诱导因子

2．7．3 PLGA表面PC12细胞诱导

2．7．4 PLGA表面诱导PC12细胞图案化

2．8 IPS细胞接种PLGA薄膜实验

2．9 PEG水凝胶上对细胞生长分化影响实验

2．9．1 PEG水凝胶空白膜的制备

2．9．2 PEG水凝胶的二次接枝

2．9．3 MTT法测PEG水凝胶上PC12细胞的活性

2．9．4 PEG水凝胶表面IPS的诱导

3 结果与分析

3．1 小鼠原代神经元细胞分离与鉴定结果

3．1．1 小鼠原代神经元细胞的荧光鉴定结果

3．1．2 小鼠原代神经元细胞的甲苯胺蓝染色结果

3．2 IPS细胞培养纯化的结果

3．2．1 小鼠成纤维细胞的分离结果

3．2．2 IPS细胞的培养结果

3．2．3 IPS细胞纯化的结果与分析

3．3 PLGA薄膜对神经类细胞生长和分化生成的影响结果与分析

3．3．1 ATR-FTIR检测PLGA表面羧基化结果

3．3．2 PLGA对神经原代细胞生长的影响结果与分析

3．3．3 PLGA对诱导PC12细胞成神经细胞影响的结果与分析

3．3．4 PLGA表面诱导PC12细胞图案化结果

3．3．5 PLGA对IPS细胞生长影响结果

3．4 PEG水凝胶对细胞生长分化影响的结果与分析

3．4．1 PEG水凝胶对PC12细胞的生长的影响结果与分析

3．4．2 IPS细胞在PEG水凝胶上诱导分化的结果

4 结论

5 讨论与展望

参考文献

致谢