杜仲内生真菌的分离与拮抗菌株的筛选

摘要

杜仲（Eucommia ulmoides Oliv.）为杜仲科杜仲属落叶乔木，中国特有经济树种，国家二级保护植物。其次生代谢产物如绿原酸、桃叶珊瑚甙、京尼平甙等具有抗菌、抗肿瘤等药理活性。植物内生菌普遍存在于各种植物中，许多内生菌能产生与宿主植物相同或相似的代谢产物，且许多是未发现过的新物质。利用内生菌筛选生物活性成分或先导化合物成为寻找天然药物的又一条重要途径，并且许多化合物对动植物致病菌有明显的抑制作用，因此在医药领域和农药领域，植物内生菌是目前研究的热点。
　　同一种植物生长在不同的环境，其内生菌的多样性及生物活性都有所不同。目前，杜仲内生真菌研究主要集中于陕西、四川、上海等地，更重要的是缺乏对分离内生真菌活性成分的研究。河南省开封市紧临黄河，位于华中与华北地区分界点，其独特的地理位置及气候条件为研究筛选植物内生菌提供了独一无二的天然资源。
　　本研究采用组织分离法从生长于河南大学药用植物园的杜仲叶和果实分离内生真菌，通过观察菌落性状、大小、颜色筛选。培养液用高效液相色谱法（HPLC）检测培养液中是否含有绿原酸、桃叶珊瑚苷等杜仲的主要活性成分。对峙培养评价每个菌株的抗菌活性。对于对峙法有抗菌活性的菌株，用生长速率法评价抗菌活性。对于抑菌效果好的内生真菌，测定ITS片段，Blast比对鉴定其种类。希望能从中分离到具有良好抑菌效果的内生真菌，为进一步提取优良生物活性和新颖化学结构的内生真菌代谢产物打下基础。结果如下：
　　1.菌种分离用1/4划线法对长出的杜仲内生菌进行分离纯化，用形态观察法和显微检测法对杜仲内生菌菌丝和孢子进行检测分类，结果显示：一共分出91株形态不同的菌株。
　　2.杜仲内生菌次级代谢产物化学成分测定7个菌株能够产生桃叶珊瑚苷；2个菌株能够产生绿原酸；没有菌株能够产生黄酮。
　　3.杜仲内生菌抑菌实验分别采用对峙法和菌丝生长速率法对杜仲内生菌进行抑菌活性的检测，供试菌禾谷丝核菌（Rhizoctonia cerealis），小麦根腐（Drechslera Sofokiniana），小麦赤霉病禾谷镰孢（Fusarium graminearum），蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）；人类致病菌有：金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），白色念珠菌（Monilia albican），猪霍乱沙门氏菌（Salmonella choleraesuis），大肠杆菌（Escherichia coli）。由抑菌实验结果可以看出分离出的菌株中对植物源的供试菌具有抑制作用的菌株较多，且对植物源供试菌具有较好的抑制作用；对动物源的供试菌具有抑制作用的菌株较少，且对动物源供试菌抑制作用较差。
　　4.分子鉴定：用试剂盒提取杜仲内生菌DNA，进行PCR扩增，生物公司测序后，序列在GeneBank上进行blast比对，对内生菌进行分子学鉴定，鉴定结果显示：1、2、7、9、11、16、18、23、26、27、29、30、42、46号菌株同属于链格孢属（Alternaria）；41号菌株属于茎点霉属(Phoma)；4号菌株属于黑孢属（Niqrospora）；31、49号菌同属于枝孢属（Cladosporium）。

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第一章 文献综述

第一节 杜仲资源基础研究概论

1 历代杜仲的利用范围

2 现代对杜仲的利用范围

3 杜仲的药理活性

4 杜仲次生代谢产物的主要类型

第二节 杜仲内生菌研究概论

第二章 杜仲内生菌的分离、拮抗菌种的筛选及分子鉴定

1 试剂与仪器

1.1 试剂与材料

1.2 仪器

2 试验方法

2.1 杜仲内生真菌的分离与纯化

2.2 拮抗菌株的筛选

2.3 活性成分检测

2.4 菌种鉴定

3 试验结果

3.1 杜仲内生真菌的分离与纯化

3.2 拮抗菌株的筛选

3.3 活性成分检测

3.4 菌种鉴定

4 讨论

5 小结

参考文献

致谢