盐胁迫下陆地棉根蛋白差异表达分析及耐盐相关基因的功能鉴定

摘要

棉花作为世界上一种重要的经济作物，不仅是重要的天然纤维来源，而且也是重要的食用油来源。相对于其它主要作物来说，虽然棉花具有较高的耐盐性，但是在高浓度的盐碱土壤中，棉花的生长、产量和品质会受到严重影响，尤其在种子萌发和苗期阶段。因此，深入研究棉花应对盐胁迫的分子机制有助于我们利用基因工程手段提高棉花的耐盐性。本研究利用同位素标记相对和绝对定量（isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ）技术鉴定出了陆地棉苗根部的早期盐反应蛋白，从蛋白质水平上了解棉花耐盐分子机理；克隆了与耐盐相关的GhCYPL和GhCaM基因，并初步验证了GhCYPL基因的功能。
　　在本研究中，以耐盐棉花品种ZMS23为材料，利用iTRAQ蛋白质组学技术对棉花苗期根部差异表达蛋白进行分析，鉴定出128个差异表达蛋白，其中有76（59.4％）个蛋白相对于对照来说表达上调，52（40.6%）表达下调。根据蛋白质功能分类，将这些蛋白主要划分为以下几个类别：胁迫反应（23.4%）、碳和能量代谢（13.3%）、转录代谢（4.7%）、蛋白质代谢（15.6%）、细胞膜和转运（10.9%）、信号转导（3.1%）、细胞结构（12.5%）、其它代谢（4.7%）和未知功能蛋白（11.7%），这些盐反应蛋白的多样性反映出盐胁迫条件下棉花根部代谢的灵活性，有助于增强棉花在盐胁迫条件下的适应能力。盐胁迫下，利用iTRAQ技术首次鉴定到一些新的蛋白参与到细胞骨架（肌动蛋白相关蛋白2, ARP2、类成束蛋白阿拉伯半乳聚糖蛋，FLAs），膜转运（液泡膜内在蛋白,TIP），信号转导（类富含亮氨酸重复受体激酶，LRR-RLKs），胁迫与防卫（类甜蛋白，TLP、普遍胁迫蛋白，USP、Dirigent-like蛋白,DIR、脱水相关蛋白PCC13-62）等代谢过程，这些蛋白有助于进一步了解植物在盐胁迫条件下的分子机制。随后对过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽S-转移酶（GST）、单脱氢抗坏血酸还原酶（MDAR）和苹果酸脱氢酶（MDH）的酶活性进行检测，经数据分析得出这些酶的活性与蛋白质丰度变化呈正相关，进一步验证了iTRAQ技术是一个能同时进行大量蛋白定性和定量的可靠技术。利用qRT-PCR技术分析POD、SOD、GST、MDAR和MDH在转录水平的表达情况，其中有4个蛋白在转录水平与蛋白质水平上表达呈正相关，这些结果说明盐胁迫条件下棉花根部蛋白质组学的复杂性。比较蛋白质组学分析加深了我们对盐胁迫条件下植物耐盐分子机制的了解。
　　克隆陆地棉GhCYPL全长基因，长度为911bp，包含一个621bp的开放阅读框，编码207个氨基酸。该基因多肽链序列含有植物亲环素基因特有的氨基酸序列KSGKPLH，含有11个磷酸化位点，1个糖基化位点和1个肽脯氨酞顺反异构酶（PPIase）的标志序列FKGSAFHRIIPNFMIQGG。基因功能预测显示该基因可能参与蛋白的折叠、装配、转运、信号传导的等重要过程。qRT-PCR分析显示GhCYPL基因在盐胁迫条件下表达上调，暗示该基因可能在增强棉花盐胁迫条件下的适应性过程中起一定作用。
　　克隆陆地棉GhCaM全长基因，长度为806bp，包含一个441bp的编码区，86bp5’端非编码区和279bp3’非编码区，编码147个氨基酸，蛋白预测显示蛋白分子量16.61KD，等电点为4.81.该蛋白的二级结构包含有4个EF臂结构域和Ca2+结合位点，表明该蛋白与其它植物钙调蛋白结构类似，推测陆地棉GhCaM蛋白可能参与信号传导，离子通道调控，生长发育和抗病抗逆等生理过程。qRT-PCR数据分析显示GhCYPL基因在盐胁迫条件下表达上调，推测该基因可能参与了棉花盐胁迫条件下的信号传导过程。
　　利用病毒诱导的基因沉默（virus induced genes silencing,VIGS）系统在陆地棉ZMS23幼苗中研究GhCYPL的基因功能。通过qRT-PCR检测得出，GhCYPL-silencing植株的GhCYPL基因的相对表达量降低了88.02%（pTRV2-空载作为阴性对照），说明VIGS基因沉默系统效率较高，可用于单个基因研究。检测结果显示，盐胁迫条件下GhCYPL-silencing植株真叶中丙二醛（MDA）和过氧化氢(H2O2)的含量远高于阴性对照，说明GhCYPL基因表达参与降低H2O2的累积和脂质过氧化水平的过程。检测盐胁迫条件下GhCYPL-silencing植株和阴性对照植株中过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和抗坏血酸过氧化物酶(APX)的酶活性，发现GhCYPL基因表达与SOD、POD和CAT酶活呈正相关，而这些酶可以降解H2O2，导致MDA含量降低。因此，可推测出GhCYPL蛋白是一个通过调节抗氧化物酶的活性来控制活性氧（ROS）的水平的调节因子。

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1文献综述?

1.1盐胁迫对植物的伤害

1.2 植物在盐胁迫下适应机制

1.3盐胁迫下的信号传导

1.4棉花耐盐性

1.5蛋白质组学研究进展

1.6棉花耐盐相关基因研究进展

1.7研究的目的意义

2耐盐棉花品种在盐胁迫下蛋白质组学研究

2.1材料和方法

2.2结果与分析

2.3讨论

2.4小结

3棉花耐盐相关基因GhCYPL和GhCaM的克隆与分析

3.1陆地棉GhCYPL基因cDNA全长的克隆与分析

3.2陆地棉GhCaM基因cDNA全长的克隆与分析

3.3小结

4棉花GhCYPL基因沉默载体构建及功能分析

4.1 TRV病毒介导的基因沉默体系

4.2材料与方法

4.3结果与分析

4.4讨论

4.5小结

5．结论

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的学术论文