TAGLN2(Transgelin-2)相互作用蛋白的鉴定

摘要

背景：Transgelin基因位于人类11号染色体，主要在平滑肌细胞及非肌细胞中表达[1,2]，已有相关资料[3]提示 Transgelin基因可能以多种形式参与到肿瘤的发生过程，可能是一种新的抑癌基因。Transgelin-2为Transgelin的同系物，Transgelin-2既表达于平滑肌细胞中，也表达于胰腺、骨髓等非平滑肌细胞中[4.5]。Transgelin-2基因所表达的蛋白被称作肌动蛋白结合蛋白，是一种重要且具有代表性的肌动蛋白结合蛋白。从结构上看，Transgelin-2蛋白具有Calponin蛋白家族重要成员之一Calponin蛋白的特性，蛋白分子结构主要由氨基末端的CH结构域(calponin homology domain)和羧基末端calponin样重复模体(calponin-like repeat, CLR)的单拷贝或者多拷贝的串联重复序列组成[6]，基本功能是和肌动蛋白结合，从而参与细胞骨架重构和调整[7,8]，可能参与肿瘤细胞的转移。Transgelin-2蛋白的功能一直被认为是对肿瘤细胞有抑制其转移的作用，目前根据GeneCards数据库和相关文献查明 Transgelin-2具体生物学功能及作用机制尚不明确[9]。Transgelin-2有可能是具有完整TAGLN或其片段（在组织或生物流体诸如血清或尿测得），可以作为一个肿瘤学“体温表”（即定点诊断标志物），用于检测侵入性恶性疾病的存在，类似于使用的C-反应蛋白（CRP）或用于检测炎性状态的红细胞沉降率（ESR）[10]。Transgelin-2蛋白有望可以作为恶性肿瘤侵袭、转移检测的指标之一，为临床鉴别肿瘤恶性程度及预后提供参考指标及治疗靶点。通过在线生物信息学基因蛋白相互作用检索工具 STRING对Transgelin-2潜在的直接或着间接相互作用蛋白进行搜索和预测，已经发现了几种可能和Transgelin-2存在相互作用关系的蛋白，这三种蛋白分别是：蛋白β-Actin(ACTB)、周期蛋白依赖性激酶2(CDK2)和细丝蛋白A(FLNA)等。发现人类癌症组织中的特异性生物标记物，对相关癌症的早期诊断和疾病的分子认识至关重要， Transgelin-2与癌症的发生和转移的关系正在受到人们的密切关注， Transgelin-2在肿瘤发生、发展和转移中的作用为肿瘤的诊断和治疗提供了新的思路。相关研究中表明[9,12-16]，Transgelin-2蛋白被认为参与了多种恶性肿瘤的发生、发展过程，并可能是特异性肿瘤标志物，将为进一步揭示 Transgelin-2的生物学功能提供新的线索和依据。
　　目的：本研究通过研究发现与 Transgelin-2蛋白相互作用的蛋白，进一步阐述Transgelin-2蛋白的功能，认识与理解肿瘤细胞如何在人体内发挥作用的生命过程，为进一步研究 Transgelin-2蛋白作用机制提供新的线索。体外pull-down实验是研究蛋白质之间相互作用的重要技术，通过体外pull-down发现与Transgelin-2相互作用的蛋白，为进一步研究Transgelin-2在抑制肿瘤生长、转移方面寻找证据及突破口，期望为肿瘤的早期诊断、治疗指导和监测治疗以及抗肿瘤药物的研发提供证据。
　　方法：从食管癌细胞NE3中提取人类全组RNA，经过反转录、PCR、电泳得到目的基因Trangelin-2的DNA克隆片段，连接T载体构建克隆载体T-Transgelin-2并测序正确后，构建原核表达质粒pGEX-6P-1-Transgelin-2，用IPTG进行蛋白诱导表达，确认诱导蛋白表达后，进行GST-Transgelin-2蛋白的纯化。准备多种肿瘤细胞并培养，利用体外pull-down技术筛选出Transgelin-2与之发生作用的肿瘤细胞并用质谱分析检测该肿瘤细胞的与Transgelin-2蛋白相互作用的蛋白。
　　结果：⑴成功从食管癌 NE3细胞中提取人类全组 RNA，反转录、PCR后得到目的基因Transgelin-2；⑵构建pGEX-6P-1-Transgelin-2原核表达质粒；⑶经IPTG诱导GST-Transgelin-2融合蛋白表达；⑷GST-Transgelin-2融合蛋白在细胞上清中表达并被成功纯化；⑸通过体外pull-down实验及质谱分析鉴定得到与Transgelin-2蛋白作用的蛋白。
　　结论：①Transgelin-2蛋白在原核细胞中得到可溶性表达并被成功纯化。②Transgelin-2蛋白与肌球蛋白重链9（myosin-9）、非常规肌球蛋白IC（Unconventional myosin-IC）存在相互物理结合，为进一步研究Transgelin-2的生物学功能打下基础。

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引言

1.实验材料

2.实验方法

2.1提取人类全组RNA

2.2 RNA反转录合成cDNA

2.3 引物设计

2.4目的基因PCR的扩增与克隆

2.5构建T-TAGLN2克隆载体并测序确认

2.6构建表达载体pGEX-6P-1-TAGLN2并鉴定

2.7 诱导表达GST-TAGLN2融合蛋白并纯化

2.8 细胞培养进行GST-TAGLN2融合蛋白的体外pull-down实验

3.结果与分析

3.1目的基因TAGLN2的获得

3.2 T克隆连接载体T-TAGLN2的鉴定

3.3 重组质粒pGEX-6P-1-TAGLN2的构建及鉴定

3.4 GST-TAGLN2融合蛋白的诱导表达及鉴定

3.5 GST-TAGLN2融合蛋白细胞可溶性分析

3.6 GST-TAGLN2融合蛋白的纯化及鉴定

3.7体外pull down实验发现与TAGLN2作用的蛋白

3.8质谱鉴定分析与TAGLN2作用的蛋白

4.讨 论

5.结 论

参考文献

综述:Transgelin及Calponine 蛋白家族相关的研究进展

致谢